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yujifeierhwf新虫 (初入文坛)
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[求助]
T-克隆构建质粒不成功 已有4人参与
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求助给位大神 PCR扩增目的产物条带单一，回收后进行克隆连接，平板蓝白斑长的正常，但挑白斑进行菌液PCR验证时只有二聚体 验证用的引物是T7/SP6的质粒通用引物。 用T-克隆试剂盒中的核酸进行克隆连接，并检测白菌落，有目的产物是对的。就是说感受态细胞和载体是正常的，根据这个结果重新获取PCR产物，但结果仍然是菌落正常，菌液验证就是没有条带，连空载的片段都没有 |
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| 前几天看到一个关于PCR实验资料问答的网站，http://www.ebioq.com/openlab/12/0，推荐你看看，我们实验室当时做不好就在这做了，还蛮好，你看看。 |
2楼2016-06-07 16:38:48
3楼2016-06-07 17:19:16
原海亮
木虫 (著名写手)
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可以从以下几方面找原因，第一，确认一下使用的聚合酶是否具有末端加A的功能，如果没有，你需要对pcr产物进行加A。第二，回收的pcr产物最好进行电泳检测，确保片段回收成功，并且可以根据其浓度调整连接体系。第三，挑取克隆进行pcr的时候，可以找个已经构建成功的质粒作为阳性对照，确保pcr体系没有问题，同时可以用片段特异性引物来辅助验证。最后，可以不进行菌液pcr或者不管菌液pcr结果如何，对挑取的克隆提质粒，对质粒进行酶切和pcr验证，这应该是最可靠的方法，因为经常会出现菌液pcr没有结果，但是酶切验证是正确的现象，所以个人觉得酶切验证及测序分析应该是判断克隆是否构建成功的依据，菌液pcr只是初筛，容易出现误差。 发自小木虫Android客户端 |
4楼2016-06-07 17:43:40
5楼2016-06-07 17:44:10
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