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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

[交流] 蛋白质纯化已有6人参与

亲们,有木有做过蛋白质纯化的呀。我包涵体用曲拉通、脲变性、透析过之后,总有白色物质析出,有木有影响啊?
我的透析袋是14000的,目的蛋白50000的。
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

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2楼: Originally posted by super_mm at 2016-06-02 14:58:23
你是包涵体复性吗?透析去除变性剂吗?白色物质应该是未复性成功的蛋白吧,肯定有影响,析出越少越好啊,把复性后的上清测蛋白浓度和SDS-PAGE,看复性率多少

好的,我试试
3楼2016-06-02 21:21:14
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by super_mm at 2016-06-02 14:58:23
你是包涵体复性吗?透析去除变性剂吗?白色物质应该是未复性成功的蛋白吧,肯定有影响,析出越少越好啊,把复性后的上清测蛋白浓度和SDS-PAGE,看复性率多少

是包涵体复性,是为了去除变性剂,我的析出来好多啊。复性率很低怎么办?
4楼2016-06-03 10:30:31
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

送红花一朵
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5楼: Originally posted by super_mm at 2016-06-03 10:46:06
摸索合适的复性条件,稀释复性,柱上复性,你可以百度查查,另外复性溶液的pH、离子强度、表面活性剂都是可以摸索的,这工作量可不小。
你可以先试试稀释复性,把待复性的溶液放入透析袋里,把透析袋直接放入到100 ...

所以稀释复性是把待复性的溶液稀释了多少呢?
6楼2016-06-03 12:03:53
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金虫 (正式写手)

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5楼: Originally posted by super_mm at 2016-06-03 10:46:06
摸索合适的复性条件,稀释复性,柱上复性,你可以百度查查,另外复性溶液的pH、离子强度、表面活性剂都是可以摸索的,这工作量可不小。
你可以先试试稀释复性,把待复性的溶液放入透析袋里,把透析袋直接放入到100 ...

我就是把待复性的溶液倒到透析袋,直接放入50倍体积的复性透析液里面,16h换新的,然后就有很多的析出物,跑胶证明是蛋白
7楼2016-06-03 13:07:51
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

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8楼: Originally posted by super_mm at 2016-06-03 16:28:04
说错了,这个方法是透析复性,不是稀释复性。这样的话你就得摸索透析液的成分了,这没什么固定的方法,只有不断的试才行。

好的,谢谢了,我也觉得是透析液的问题,可能不同的蛋白质透析液影响挺大的吧
9楼2016-06-03 16:33:25
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

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10楼: Originally posted by baima at 2016-06-03 17:06:41
你是梯度透析吗?比如说,我纯化的蛋白样品是含8M尿素,我先用4M尿素的透析液,再换2M,再换1M,最后0M。复性过程切记不要过快,而且最好低温进行。我们一般都是在4度搅拌透析的
...

我跟你的正好相反哎,我是0, 2M, 4M, 8M。分别收集沉淀,沉淀,沉淀,上清。
4度透析16h以上,换一次新透析液,再透析16h以上。  
就是透析之后,好多白色絮状物质,离心我检测了这些东西是蛋白。上清过柱子之后检测什么也没有
11楼2016-06-03 17:13:04
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

[quote]12楼: Originally posted by baima at 2016-06-03 18:36:09
过纯化柱之前为什么要梯度透析呢?我都是直接用8M变性裂解液溶解裂解沉淀,,上清用来蛋白纯化,收集含目的蛋白的洗脱峰用于后续梯度透析。。。。
... [/quote
不好意思,我理解错你了。我也是用8M的脲溶解包涵体,然后透析的,你的意思是这里你用的是梯度对吧?我是直接放在0M的脲里面透析两次的,出来就全部成絮状沉淀了。是不是浓度差太大了造成的这个原因。
16楼2016-06-13 09:13:54
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12楼: Originally posted by baima at 2016-06-03 18:36:09
过纯化柱之前为什么要梯度透析呢?我都是直接用8M变性裂解液溶解裂解沉淀,,上清用来蛋白纯化,收集含目的蛋白的洗脱峰用于后续梯度透析。。。。
...

你就是这样做出来的是吧?我也试试梯度透析的方法
17楼2016-06-13 11:31:04
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

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14楼: Originally posted by XMC-7 at 2016-06-06 15:40:37
能否把完整的方法发出来?...

就是变形和复性这两个过程,变性就很简单了,高浓度的脲或者盐酸胍变性。
复性就有些麻烦,我暂时没有复性成功的
18楼2016-06-13 11:32:27
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