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花落已季末

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[求助] 质粒切不开已有4人参与

内切酶用的XbaI，位于我的目的基因两边，测序结果表明酶切位点序列正确，两边也没有甲基化位点，想用XbaI进行酶切，但调整质粒浓度，酶量，反应体系，酶切时间，更换新的内切酶，始终切不开，求教各位高手

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流年似水，看不透的是红尘中镜花水月；往事如烟，挥不去的是岁月荏苒一过往；待得繁华落尽，只余回忆。

1楼 2016-05-29 22:48:32

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原海亮

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【答案】应助回帖

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你的基因是连在质粒载体上对吧，这两个xbai位点是质粒上的？还是你插入的目的基因上的？所谓的切开，是电泳显示把你目的基因切下来？不清楚你进行酶切的目的是做什么，如果是酶切验证克隆，可以更换其他酶来处理，只要能切出正确大小即可。如果是为了回收目的片段进行亚克隆，我不清楚为什么选择单酶切，当然实在切不下来，你可以通过pcr扩增来获得目的片段。对于你说的切不开，我猜测的原因:测序显示酶切位点正确，其实这个不应该是在你测序前就已经构建好正确的图谱了么，除非你的目的基因是未知序列，然后测序结果来和你的理论序列对比看是否正确，而且测序结果最好有平行的，一个测序结果通常说服力太小。另一个就是要你确定这个酶切位点是否被甲基化，，毕竟xbai还是非常容易被甲基化或者其他修饰的，可以参考这个酶的说明书，尽量在甲基化缺陷的感受态进行克隆，祝好！

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