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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 转化问题
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絮燕菲菲

新虫 (小有名气)

[求助] 转化问题 已有3人参与

做转化之前没出现什么差错，都是按照标准步骤来的，但是这个星期不管我重复多少次，都没有长出菌落，好不容易长出的菌落是空载，我是先用T载体连接以后再转化的，刚开始以为是转化出了问题，但是重复了三次都没有长出菌落，会不会是我切胶回收时候把A尾巴弄掉了，根本就没有连上啊，不是转化的问题。。请求大家支招

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1楼 2016-05-26 08:28:32
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黄小萌萌

银虫 (小有名气)
★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰·手有余香，谢谢你的理解与支持。myprayer祝您科研顺利，文章多多。 2016-05-26 17:54:33
有没有做对照？没有对照的话，出现问题不好说

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2楼2016-05-26 10:02:22
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yesucao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1、Taq酶是高保真还是普通的呢？普通的不需要加A，高保真的需要加A；
2、PCR产物有多大，PCR产物切胶纯化后，是否电泳检测有条带呢？浓度大致有多少？
3、连接时根据PCR产物的大小和浓度，大致判断模板加入量，连接时间和温度正常；
4、转化时除考虑实验操作外，确保感受态没有问题；
5、菌液涂板时抗生素类型和浓度要求确保没有问题。
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3楼2016-05-26 21:51:34
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yaohuaibing

铁杆木虫 (著名写手)
首先跑胶时，尽量低电压，时间久点跑。 让条带分开的宽，好切，最好点2孔重复样，回收2孔的胶。用的是什么酶 ？ 我也正在做，长出菌落了
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每天都在读书和读人。书易懂，人难解。
4楼2016-05-28 00:22:18
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kingjazz23

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感觉做TA克隆一般很难做不出来，切胶回收也不会把A弄掉，你的连接体系是什么？检查一下连接酶有没有问题，做个对照。
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5楼2016-05-28 14:07:40
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西雨落

银虫 (初入文坛)
转化的时候可以适当延长时间试试

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6楼2016-05-28 14:15:31
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fMssop

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

楼主出现这种问题，也重复很多次实验，我觉得应该排除手法问题。如果不是系统性错误，例如感受态失效，克隆不好用等待之类的问题。那就有可能是毒性表达，既连接的目的片段表达的产物对菌体有害。任何载体都存在微量的表达情况，即使不存在诱导条件。楼主可换成拷贝载体或者耐毒性感受态。其次将培养温度换成25度试试。希望能帮到你
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7楼2016-05-30 10:59:16
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s4f5h7

新虫 (小有名气)
仔细检查，回想每个步骤，加油！
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8楼2016-05-30 11:38:44
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