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絮燕菲菲

新虫 (小有名气)

[求助] 转化问题 已有3人参与

做转化之前没出现什么差错,都是按照标准步骤来的,但是这个星期不管我重复多少次,都没有长出菌落,好不容易长出的菌落是空载,我是先用T载体连接以后再转化的,刚开始以为是转化出了问题,但是重复了三次都没有长出菌落,会不会是我切胶回收时候把A尾巴弄掉了,根本就没有连上啊,不是转化的问题。。请求大家支招

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黄小萌萌

银虫 (小有名气)


myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰·手有余香,谢谢你的理解与支持。myprayer祝您科研顺利,文章多多。 2016-05-26 17:54:33
有没有做对照?没有对照的话,出现问题不好说

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2楼2016-05-26 10:02:22
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yesucao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
1、Taq酶是高保真还是普通的呢?普通的不需要加A,高保真的需要加A;
2、PCR产物有多大,PCR产物切胶纯化后,是否电泳检测有条带呢?浓度大致有多少?
3、连接时根据PCR产物的大小和浓度,大致判断模板加入量,连接时间和温度正常;
4、转化时除考虑实验操作外,确保感受态没有问题;
5、菌液涂板时抗生素类型和浓度要求确保没有问题。
3楼2016-05-26 21:51:34
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yaohuaibing

铁杆木虫 (著名写手)

首先跑胶时,尽量低电压,时间久点跑。 让条带分开的宽,好切,最好点2孔重复样,回收2孔的胶。用的是什么酶 ? 我也正在做,长出菌落了
每天都在读书和读人。书易懂,人难解。
4楼2016-05-28 00:22:18
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kingjazz23

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
感觉做TA克隆一般很难做不出来,切胶回收也不会把A弄掉,你的连接体系是什么?检查一下连接酶有没有问题,做个对照。
5楼2016-05-28 14:07:40
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西雨落

银虫 (初入文坛)

转化的时候可以适当延长时间试试

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6楼2016-05-28 14:15:31
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fMssop

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

楼主出现这种问题,也重复很多次实验,我觉得应该排除手法问题。如果不是系统性错误,例如感受态失效,克隆不好用等待之类的问题。那就有可能是毒性表达,既连接的目的片段表达的产物对菌体有害。任何载体都存在微量的表达情况,即使不存在诱导条件。楼主可换成拷贝载体或者耐毒性感受态。其次将培养温度换成25度试试。希望能帮到你
7楼2016-05-30 10:59:16
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s4f5h7

新虫 (小有名气)

仔细检查,回想每个步骤,加油!
8楼2016-05-30 11:38:44
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