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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 从这个质粒图上看，想用XbaI做酶切位点的话，设计引物是不是要补两个碱基？
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sdjnyxn123

银虫 (小有名气)

[求助] 从这个质粒图上看，想用XbaI做酶切位点的话，设计引物是不是要补两个碱基？ 已有2人参与

从这个质粒图上看，想用XbaI做酶切位点的话，设计引物是不是要补两个碱基？

质粒融合表达部分的序列

我想用EcoRI和XbaI做酶切位点
EcoRI是不是需要在我设计的引物的GAATTC后面补一个碱基，再加我的目的基因呢？

还有后面的XbaI，为什么要设计成这个样子，这样的话要想表达出后面的his标签，是不是需要在TCTAGA前面补两个碱基？


但是我一个师姐完全没管后面的XbaI，直接按照表达的氨基酸设计的引物序列，也就是目的基因是三的倍数
然后过镍柱也纯化出来了？所以说到底加不加碱基也搞不懂了···

望了解的朋友赐教！非常感谢
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1楼 2016-05-02 09:04:05
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ...
感谢参与，应助指数 +1
sdjnyxn123: 金币+100, ★★★★★最佳答案 2016-05-09 09:50:36
EcoRI是不是需要在我设计的引物的GAATTC后面补一个碱基，再加我的目的基因呢？
（是！）
还有后面的XbaI，为什么要设计成这个样子，这样的话要想表达出后面的his标签，是不是需要在TCTAGA前面补两个碱基？
（是！）
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2楼2016-05-02 11:37:07
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

但是我一个师姐完全没管后面的XbaI，直接按照表达的氨基酸设计的引物序列，也就是目的基因是三的倍数
然后过镍柱也纯化出来了？

你师姐是不是也没管EcoRI啊，如果恰巧没遇到突变的终止密码子，那么有可能后面的his-tag还是活的啊。。
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3楼2016-05-02 11:37:43
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sdjnyxn123

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2016-05-02 11:37:43
但是我一个师姐完全没管后面的XbaI，直接按照表达的氨基酸设计的引物序列，也就是目的基因是三的倍数
然后过镍柱也纯化出来了？

你师姐是不是也没管EcoRI啊，如果恰巧没遇到突变的终止密码子，那么有可能后面的 ...

感谢回答

她用的第一个限制酶是XhoI，然后加了一段就是质粒上面的序列，到多克隆位点前面，也就是质粒图上翻译出的那个Ala（GCA）就加自己的目的基因了

首先我不清楚那个ClaI指着的框，框住6个碱基是啥意思，她这样会不会断开某个表达的序列
单说上游表达应该是没问题

但是下游她也是用的XbaI，没多加碱基，就那么表达的，她现在毕业一年多了也找不到当时测序回来的邮件了，按理说她这样的话后面应该表达不出his标签啊···
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4楼2016-05-02 12:08:45
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kungfu2016

新虫 (正式写手)
你将XhoI位点前6个碱基到EAEA的序列做引物克隆到的蛋白序列前面，用XhoI和XbaI切连，应该没有问题的

发自小木虫Android客户端
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5楼2016-05-03 23:16:04
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守望海贝

捐助贵宾 (小有名气)

【答案】应助回帖

EcoRI  需要在你设计的引物的GAATTC后面补一个碱基，再加我的目的基因呢？
XbaI  不需要在TCTAGA前面补两个碱基（你只要保证GAATTC后面补一个碱基后，剩下的目的基因序列是3的倍数，我说的不包括酶切位点的序列。因为按照3个密码子翻译为一个蛋白，到XbaI 之前，只要目的基因序列是3的倍数，翻译到XbaI时，正好按照TTT CTA  GAA 的顺序范围，没有出现密码子错位）
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6楼2016-05-05 13:57:27
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