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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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你的蛔虫

新虫 (初入文坛)

[求助] 用T4酶做载体自连接,不长克隆,求大家给支招 已有1人参与

最近在做质粒构建,目的载体11000bp,目的片段1000bp.之前一直在用TAKARA的in-fusion重组酶连接,无论怎么连都不长菌,后来打算用T4连接,我先把单酶切的载体加T4连接酶做了自连接,看是否长菌,结果这都不长菌,载体自连接体系10ul,载体200ng左右。抗性和感受态都没有问题,做了阳性对照。为什么载体自连接都不长菌,这是不是很诡异,想破了脑袋,也分析不出原因,求各位有经验的虫友们分析原因
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梅太奇阿拉干

木虫 (小有名气)

增大目标片段的浓度,设个链接梯度,1比1,1比2,1比3,1比4,然后混合后转化试试

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2楼2016-04-19 20:22:58
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jingyu90217

新虫 (小有名气)

会不会载体就没切开 所以连不上

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3楼2016-04-23 01:38:36
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yaodada123

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

楼主我也碰到了一样的问题,目的片段和载体T4连接后片段大小在8kb,用乙醇沉淀后电转,始终不长菌!电感受态细胞无问题,质粒单酶切后酶连做电转有菌落生成。实在不知道原因,求楼主赐教,谢谢~
4楼2017-08-17 12:06:43
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5楼2017-08-17 20:15:48
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6楼2017-08-18 01:44:36
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7楼2017-08-18 16:22:41
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8楼2017-08-19 00:55:14
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9楼2017-08-20 16:01:41
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10楼2017-08-20 23:44:48
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