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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 用T4酶做载体自连接，不长克隆，求大家给支招
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你的蛔虫

新虫 (初入文坛)

[求助] 用T4酶做载体自连接，不长克隆，求大家给支招 已有1人参与

最近在做质粒构建，目的载体11000bp,目的片段1000bp.之前一直在用TAKARA的in-fusion重组酶连接，无论怎么连都不长菌，后来打算用T4连接，我先把单酶切的载体加T4连接酶做了自连接，看是否长菌，结果这都不长菌，载体自连接体系10ul,载体200ng左右。抗性和感受态都没有问题，做了阳性对照。为什么载体自连接都不长菌，这是不是很诡异，想破了脑袋，也分析不出原因，求各位有经验的虫友们分析原因
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1楼 2016-04-18 09:28:15
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jingyu90217

新虫 (小有名气)
会不会载体就没切开 所以连不上

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3楼2016-04-23 01:38:36
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梅太奇阿拉干

木虫 (小有名气)
增大目标片段的浓度，设个链接梯度，1比1，1比2，1比3，1比4，然后混合后转化试试

发自小木虫Android客户端
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2楼2016-04-19 20:22:58
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yaodada123

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

楼主我也碰到了一样的问题，目的片段和载体T4连接后片段大小在8kb，用乙醇沉淀后电转，始终不长菌！电感受态细胞无问题，质粒单酶切后酶连做电转有菌落生成。实在不知道原因，求楼主赐教，谢谢~
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4楼2017-08-17 12:06:43
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