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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切切不出来目的条带。。。
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

[求助] 双酶切切不出来目的条带。。。 已有5人参与

用公司返还的 目的基因的 质粒，双酶切（BamH1和EcoR1）切了三个小时，都是一两千的条带，没有我的目的条带。是怎么回事？
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1楼 2016-03-25 20:37:59
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
返还的质粒是帮你构建的么？信息你有么，包括目的基因大小，酶切位点等

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
2楼2016-03-25 20:45:24
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kaobo2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果质粒正确的话。可以把质粒转化到DH5a等其他菌中，然后挑选克隆、提质粒、酶切鉴定。因为公司给你的质粒，纯度可能不高。也是会影响酶切的。
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3楼2016-03-25 22:36:20
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d532886741

新虫 (初入文坛)
扩繁一批再切吧、

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4楼2016-03-26 09:54:09
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玉兔Jane

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
2楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-25 20:45:24
返还的质粒是帮你构建的么？信息你有么，包括目的基因大小，酶切位点等

双酶切（BamH1和EcoR1）切了三个小时，都是一两千的条带，没有我的目的条带。
补充：3个小时，会不会产生了非特异酶切，就是除了BamH1和EcoR1特异序列切开了，还切开了别的地方？
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5楼2016-03-26 17:26:58
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kwkw

木虫 (著名写手)
建议看一下你的测序结果，找一下序列上酶切位点的位置对不对，这两个酶三个小时一般没问题。

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再苦：也别忘记坚持！再烦：也别忘记微笑！再急：也要注意语气！再累：也要爱自己！低调做人，你会一次比一次稳健。高调做事，你会一次比一次优秀！
6楼2016-03-26 18:38:58
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by kwkw at 2016-03-26 18:38:58
建议看一下你的测序结果，找一下序列上酶切位点的位置对不对，这两个酶三个小时一般没问题。

对的，跟我设计的一摸一样。我的pet32a也切出来了，就是目的基因，难道是公司返还的质粒不好么？我现在在用pcr切角产物重新双酶切试试
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7楼2016-03-27 10:51:46
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-25 20:45:24
返还的质粒是帮你构建的么？信息你有么，包括目的基因大小，酶切位点等

就是我做克隆去测序之后，公司返还我的质粒
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8楼2016-03-27 10:52:48
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by kaobo2012 at 2016-03-25 22:36:20
如果质粒正确的话。可以把质粒转化到DH5a等其他菌中，然后挑选克隆、提质粒、酶切鉴定。因为公司给你的质粒，纯度可能不高。也是会影响酶切的。

嗯，我用PCR切胶回收的产物，做个双酶切可以么？我准备试试
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9楼2016-03-27 10:54:01
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kaobo2012

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 凯伦爱佳佳 at 2016-03-27 10:54:01
嗯，我用PCR切胶回收的产物，做个双酶切可以么？我准备试试...

PCR产物切胶回收目的条带，再酶切、电泳回收目的条带、连接是可以的。
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10楼2016-03-27 14:28:38
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