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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸杂交 » 载体构建问题
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-字仲康

禁虫 (正式写手)
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1楼 2016-03-24 20:46:21
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star013

新虫 (知名作家)
我们帮你构建如何\

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2楼2016-03-25 07:15:06
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-字仲康

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3楼2016-03-25 08:13:42
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jackie在努力

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
-字仲康: 金币+5, ★★★很有帮助 2016-03-29 22:09:20
如果感受态和操作都没问题的话：
①不知道楼主是否比较过胶回收后的载体片段和目的片段的浓度；
②另外楼主可以用相同浓度的载体的做下单酶切实验（分别sacI和NdeI），并和双酶切一起跑胶看下结果，看下是不是NdeI的活性不高，我们实验室一般50微升的体系右2.5微升的酶
③saCI 和 Nde双酶切会切去50bp左右的片段，不知道提高楼主的琼脂糖浓度可不可以分辨出
④另外连接效率不高的可以过夜连接，培养液离心浓缩，多挑几个单菌落（多挑几个不会浪费很多时间）
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4楼2016-03-29 20:07:55
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rfywoaini

银虫 (初入文坛)
挑单菌落吧，多找几个，7个左右吧

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萧瑟秋风今又是，换了人间。
5楼2016-03-29 21:12:35
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-字仲康

禁虫 (正式写手)
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6楼2016-03-29 22:12:31
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jingyu90217

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by -字仲康 at 2016-03-29 22:12:31
浓度的话，我们没有认真的计算，单酶切的话，开始也觉得是NDE1酶切效果不好的，就先单酶切了，发现是可以切得开的。然后在琼脂糖凝胶中是不能分辨出有没有双酶切完全的。连接效率的话，也还好，没有进行过夜了。
...

你好。请问你分步酶切是用的氯仿抽提的方法吗？还是直接第一步切完用柱回收试剂盒呢？你的酶切体系是怎么样的呢？我前面在50微体系里切5微克质粒。两种酶各加了一微。跑胶有线性化。但是转化好多假阳性。怀疑酶切不完全。

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7楼2016-04-13 01:42:10
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苦逼岁月

新虫 (正式写手)
大家好，我是新手对于构建质粒！
第一个问题是如何看质粒上的MCS（多克隆位点），是质粒图谱上标准的所有酶切位点上都是MCS，还是只是粗黑色箭头表示的区域是MCS？
第二个问题就是我实际中的碰到的问题，本实验室只有pET-32a这个表达载体，然而我老师想用pET-SUMO这个质粒，所以我们就自己构建；我们首先问别人要到了SUMO基因的模版，然后分别用带有酶切位点的引物把SUMO基因扩出来酶切（Ndel+Bamh1）;然后用Ndel+Bamh1酶切质粒pET-32a;然后连接转化，现在总是做不出来，问题就是这样做有问题么？嗯，我也问了群里的一些人，他们说你这样做应该做不出来，他们说我用Ndel这个酶切位点第一不再MCS上，第二他有两个酶切位置，你这样酶切会把质粒切碎，破坏质粒的完整性，肯定扩不出来！所以我想请问大家一下！！！！
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8楼2016-08-16 09:42:11
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