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-字仲康

禁虫 (正式写手)

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star013

新虫 (知名作家)


2楼2016-03-25 07:15:06
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-字仲康

禁虫 (正式写手)

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3楼2016-03-25 08:13:42
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jackie在努力

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
-字仲康: 金币+5, ★★★很有帮助 2016-03-29 22:09:20
如果感受态和操作都没问题的话:
①不知道楼主是否比较过胶回收后的载体片段和目的片段的浓度;
②另外楼主可以用相同浓度的载体的做下单酶切实验(分别sacI和NdeI),并和双酶切一起跑胶看下结果,看下是不是NdeI的活性不高,我们实验室一般50微升的体系右2.5微升的酶
③saCI 和 Nde双酶切会切去50bp左右的片段,不知道提高楼主的琼脂糖浓度可不可以分辨出
④另外连接效率不高的可以过夜连接,培养液离心浓缩,多挑几个单菌落(多挑几个不会浪费很多时间)
4楼2016-03-29 20:07:55
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rfywoaini

银虫 (初入文坛)

挑单菌落吧,多找几个,7个左右吧

发自小木虫IOS客户端
萧瑟秋风今又是,换了人间。
5楼2016-03-29 21:12:35
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-字仲康

禁虫 (正式写手)

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6楼2016-03-29 22:12:31
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jingyu90217

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by -字仲康 at 2016-03-29 22:12:31
浓度的话,我们没有认真的计算,单酶切的话,开始也觉得是NDE1酶切效果不好的,就先单酶切了,发现是可以切得开的。然后在琼脂糖凝胶中是不能分辨出有没有双酶切完全的。连接效率的话,也还好,没有进行过夜了。
...

你好。请问你分步酶切是用的氯仿抽提的方法吗?还是直接第一步切完用柱回收试剂盒呢?你的酶切体系是怎么样的呢?我前面在50微体系里切5微克质粒。两种酶各加了一微。跑胶有线性化。但是转化好多假阳性。怀疑酶切不完全。

发自小木虫IOS客户端
7楼2016-04-13 01:42:10
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苦逼岁月

新虫 (正式写手)

大家好,我是新手对于构建质粒!
第一个问题是如何看质粒上的MCS(多克隆位点),是质粒图谱上标准的所有酶切位点上都是MCS,还是只是粗黑色箭头表示的区域是MCS?
第二个问题就是我实际中的碰到的问题,本实验室只有pET-32a这个表达载体,然而我老师想用pET-SUMO这个质粒,所以我们就自己构建;我们首先问别人要到了SUMO基因的模版,然后分别用带有酶切位点的引物把SUMO基因扩出来酶切(Ndel+Bamh1);然后用Ndel+Bamh1酶切质粒pET-32a;然后连接转化,现在总是做不出来,问题就是这样做有问题么?嗯,我也问了群里的一些人,他们说你这样做应该做不出来,他们说我用Ndel这个酶切位点第一不再MCS上,第二他有两个酶切位置,你这样酶切会把质粒切碎,破坏质粒的完整性,肯定扩不出来!所以我想请问大家一下!!!!
8楼2016-08-16 09:42:11
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