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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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-字仲康

禁虫 (正式写手)

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苦逼岁月

新虫 (正式写手)

大家好,我是新手对于构建质粒!
第一个问题是如何看质粒上的MCS(多克隆位点),是质粒图谱上标准的所有酶切位点上都是MCS,还是只是粗黑色箭头表示的区域是MCS?
第二个问题就是我实际中的碰到的问题,本实验室只有pET-32a这个表达载体,然而我老师想用pET-SUMO这个质粒,所以我们就自己构建;我们首先问别人要到了SUMO基因的模版,然后分别用带有酶切位点的引物把SUMO基因扩出来酶切(Ndel+Bamh1);然后用Ndel+Bamh1酶切质粒pET-32a;然后连接转化,现在总是做不出来,问题就是这样做有问题么?嗯,我也问了群里的一些人,他们说你这样做应该做不出来,他们说我用Ndel这个酶切位点第一不再MCS上,第二他有两个酶切位置,你这样酶切会把质粒切碎,破坏质粒的完整性,肯定扩不出来!所以我想请问大家一下!!!!
8楼2016-08-16 09:42:11
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star013

新虫 (知名作家)


2楼2016-03-25 07:15:06
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-字仲康

禁虫 (正式写手)

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3楼2016-03-25 08:13:42
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jackie在努力

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
-字仲康: 金币+5, ★★★很有帮助 2016-03-29 22:09:20
如果感受态和操作都没问题的话:
①不知道楼主是否比较过胶回收后的载体片段和目的片段的浓度;
②另外楼主可以用相同浓度的载体的做下单酶切实验(分别sacI和NdeI),并和双酶切一起跑胶看下结果,看下是不是NdeI的活性不高,我们实验室一般50微升的体系右2.5微升的酶
③saCI 和 Nde双酶切会切去50bp左右的片段,不知道提高楼主的琼脂糖浓度可不可以分辨出
④另外连接效率不高的可以过夜连接,培养液离心浓缩,多挑几个单菌落(多挑几个不会浪费很多时间)
4楼2016-03-29 20:07:55
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