应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » CDS序列扩增条带暗，求解，急！急！急！！
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
52/1返回列表
查看: 2724  |  回复: 11
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

若无敌12138

银虫 (正式写手)

[求助] CDS序列扩增条带暗，求解，急！急！急！！ 已有2人参与

最近在做基因表达，扩CDS全长, 片段900左右，从CDS序列头尾上设计的引物，用基因组不保险，所以用的Q5高保真酶扩的cDNA，但条带一直都一直不是很亮，RNA反转录成cDNA这一步没问题，都测过浓度的，并且cDNA稀释了50倍扩的。后面要做片段融合，试过切胶回收，PCR产物直接回收浓度都非常低，没法做下一步，怎么破？CDS的GC含量不高，51%，引物Tm值相差大概3度，GC没问题，见下图左边较暗的4条带

1.确定cDNA没问题
2.酶没问题
3.引物的话，是头尾确定的吧

如果是体系的话，退火温度已经调到很低了，从65,63,60都试过，条带也不亮，切胶基本没有，AXYGEN、QUIGEN的都用过，不纯化吧，对后续实验可能会有影响，有人碰到类似的情况吗？？

CDS序列扩增条带暗，求解，急！急！急！！
P60321-222820.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2016-03-23 11:16:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

大神88
，

发自小木虫Android客户端
12楼2016-03-26 16:54:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 12 个回答

卡维斯

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
若无敌12138: 金币+3, ★有帮助 2016-03-23 12:57:54
增加下模板浓度，稀释到10倍。程序上尝试下touchdown程序
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2016-03-23 11:31:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhijiangli

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
若无敌12138: 金币+3 2016-03-23 12:58:06
用pcr产物为模板扩增，循环数降低10-15个。试试
赞一下 回复此楼
缘分这东西O(∩_∩)O~
3楼2016-03-23 11:38:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

若无敌12138

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-23 11:31:04
增加下模板浓度，稀释到10倍。程序上尝试下touchdown程序

谢谢建议，最先用的就是touchdown，从65,63到62 30s，从62,60到58 30s也试过，总共30个循环，更暗，后来一次性退火，还亮一点点，并不是非特异性扩增的问题
赞一下 回复此楼
4楼2016-03-23 12:56:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 12 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 304求调剂（085602，过四级，一志愿985） +14 化工人999 2026-04-04 14/700 2026-04-05 13:55 by imissbao
[考研] 一志愿北交大材料工程总分358求调剂 +4 cs0106 2026-04-05 4/200 2026-04-05 13:25 by jp9609
[考研] 266分，一志愿电气工程，本科材料，求材料专业调剂 +5 哇呼哼呼哼 2026-04-02 6/300 2026-04-05 11:49 by 风雨无晴
[考研] 283分求调剂 +9 试试看呗 2026-04-04 9/450 2026-04-05 10:27 by 果冻大王
[考研] 材料与化工363求推荐 +7 zh096 2026-04-04 7/350 2026-04-05 09:11 by 陌秋26
[考研] 283求调剂 +10 A child 2026-04-04 10/500 2026-04-05 08:22 by qlm5820
[考研] 复试调剂 +6 范根培 2026-04-04 6/300 2026-04-04 14:27 by 土木硕士招生
[考研] 一志愿沪985，326分求调剂 +3 刘墨墨 2026-04-03 3/150 2026-04-04 11:16 by 悲伤的芋头
[考研] 322求调剂 +4 FZAC123 2026-04-03 4/200 2026-04-03 20:55 by zhq0425
[考研] 11408，284分，二战真诚求调剂 +4 12.27 2026-04-02 4/200 2026-04-03 14:14 by dxiaoxin
[考研] 275求调剂 +14 waltzh 2026-04-01 14/700 2026-04-03 11:24 by qqq850810
[考研] 285求调剂 +7 AZMK 2026-04-02 9/450 2026-04-03 11:12 by wanwan00
[考研] 273求调剂 +20 李芷新1 2026-03-31 20/1000 2026-04-03 09:58 by linyelide
[考研] 材料调剂 +4 一样YWY 2026-04-03 4/200 2026-04-03 09:48 by 蓝云思雨
[考研] 一志愿陕西师范大学生物学317分 +5 1563日。 2026-04-02 5/250 2026-04-03 06:58 by ilovexiaobin
[考研] 285求调剂 +8 AZMK 2026-04-02 11/550 2026-04-02 20:16 by yulian1987
[考研] 能源动力 调剂 +3 不破不立0 2026-04-02 3/150 2026-04-02 12:46 by ffffjjjj
[考研] 调剂申请 +8 张张张张zy 2026-03-31 9/450 2026-04-01 08:29 by zjbkx
[考研] 一志愿西交大080500材料学硕349 +6 jqx1258 2026-03-31 7/350 2026-03-31 21:08 by yuq
[考研] 物理学调剂 +4 小羊36 2026-03-30 4/200 2026-03-31 16:16 by lishahe
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭