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若无敌12138

银虫 (正式写手)

[求助] CDS序列扩增条带暗,求解,急!急!急!! 已有2人参与

最近在做基因表达,扩CDS全长, 片段900左右,从CDS序列头尾上设计的引物,用基因组不保险,所以用的Q5高保真酶扩的cDNA,但条带一直都一直不是很亮,RNA反转录成cDNA这一步没问题,都测过浓度的,并且cDNA稀释了50倍扩的。后面要做片段融合,试过切胶回收,PCR产物直接回收浓度都非常低,没法做下一步,怎么破?CDS的GC含量不高,51%,引物Tm值相差大概3度,GC没问题,见下图左边较暗的4条带

1.确定cDNA没问题
2.酶没问题
3.引物的话,是头尾确定的吧

如果是体系的话,退火温度已经调到很低了,从65,63,60都试过,条带也不亮,切胶基本没有,AXYGEN、QUIGEN的都用过,不纯化吧,对后续实验可能会有影响,有人碰到类似的情况吗??

CDS序列扩增条带暗,求解,急!急!急!!
P60321-222820.jpg
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12楼2016-03-26 16:54:19
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卡维斯

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
若无敌12138: 金币+3, 有帮助 2016-03-23 12:57:54
增加下模板浓度,稀释到10倍。程序上尝试下touchdown程序
2楼2016-03-23 11:31:04
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zhijiangli

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
若无敌12138: 金币+3 2016-03-23 12:58:06
用pcr产物为模板扩增,循环数降低10-15个。试试
缘分这东西O(∩_∩)O~
3楼2016-03-23 11:38:14
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若无敌12138

银虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-23 11:31:04
增加下模板浓度,稀释到10倍。程序上尝试下touchdown程序

谢谢建议,最先用的就是touchdown,从65,63到62 30s,从62,60到58 30s也试过,总共30个循环,更暗,后来一次性退火,还亮一点点,并不是非特异性扩增的问题
4楼2016-03-23 12:56:09
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