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重组时质粒与目的片段连不上！求帮解答~ 已有2人参与
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| 我最近用SphI和KpnI双酶切质粒5400bp和目的片段1431bp，用T4连接酶进行连接，之后转化，板长得很正常，但是菌液PCR时不能P出目的条带，已经重复好几次连接转化了还是不能P出目的条带，是否有什么高见？求解答！谢谢！ |
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梅太奇阿拉干
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p不出条带的菌落是假阳性，可能是载体自连，可以设个阴性对照，只加载体不加目的基因链接，如果链接产物转化后没有菌落，就可以排除载体自连，也可以多扩增一些载体，然后电泳胶回收线型载体，再做链接，链接时目的基因比载体的量在2-6左右效果比较好 发自小木虫Android客户端 |
11楼2016-03-24 23:02:43
原海亮
木虫 (著名写手)
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
小秀子子: 金币+3 2016-03-22 19:33:16
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一方面在进行重新处理载体和片段时，建议将上次酶切处理过得载体片段也加入体系再次酶切进行连接转化，这样可以保证最后是有一部分经过两次酶切的，处理应该比较完全。另一方面，做菌液pcr，虽然简便但是常常会有些异常状况，最准确的方法应该是提取质粒做双酶切验证。祝好！ 发自小木虫Android客户端 |
2楼2016-03-21 16:24:30
3楼2016-03-21 20:19:46
star013 
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4楼2016-03-22 08:17:24