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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 重组时质粒与目的片段连不上！求帮解答~
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小秀子子

新虫 (初入文坛)

[求助] 重组时质粒与目的片段连不上！求帮解答~ 已有2人参与

我最近用SphI和KpnI双酶切质粒5400bp和目的片段1431bp，用T4连接酶进行连接，之后转化，板长得很正常，但是菌液PCR时不能P出目的条带，已经重复好几次连接转化了还是不能P出目的条带，是否有什么高见？求解答！谢谢！
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1楼 2016-03-21 15:42:30
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小秀子子: 金币+3 2016-03-22 19:33:16
一方面在进行重新处理载体和片段时，建议将上次酶切处理过得载体片段也加入体系再次酶切进行连接转化，这样可以保证最后是有一部分经过两次酶切的，处理应该比较完全。另一方面，做菌液pcr，虽然简便但是常常会有些异常状况，最准确的方法应该是提取质粒做双酶切验证。祝好！

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
2楼2016-03-21 16:24:30
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笔笔小结

新虫 (初入文坛)
重组质粒构建好后，应该做一次酶切，再测序验证。正确后，再转化吧
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3楼2016-03-21 20:19:46
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普通回帖

star013

新虫 (知名作家)
我们公司可以做克隆转化，便宜

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4楼2016-03-22 08:17:24
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小秀子子

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-21 16:24:30
一方面在进行重新处理载体和片段时，建议将上次酶切处理过得载体片段也加入体系再次酶切进行连接转化，这样可以保证最后是有一部分经过两次酶切的，处理应该比较完全。另一方面，做菌液pcr，虽然简便但是常常会有些 ...

我怕会不能酶切完全因此有一次都切了十几个小时，再连接转化，可是菌液pcr还是没有条带的。
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5楼2016-03-22 19:32:59
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小秀子子

新虫 (初入文坛)
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4楼: Originally posted by star013 at 2016-03-22 08:17:24
我们公司可以做克隆转化，便宜

我们导师让自己做
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6楼2016-03-22 19:36:01
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 小秀子子 at 2016-03-22 19:32:59
我怕会不能酶切完全因此有一次都切了十几个小时，再连接转化，可是菌液pcr还是没有条带的。...

额，十几个小时有点过了，不过还是建议你提质粒酶切，菌液pcr做初筛方便，但是会有扩不出来，而酶切验证是正确的

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
7楼2016-03-22 19:38:05
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wj2423311236

银虫 (小有名气)
你做菌液pcr时挑了几个菌落？

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8楼2016-03-22 19:44:23
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小秀子子

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-22 19:38:05
额，十几个小时有点过了，不过还是建议你提质粒酶切，菌液pcr做初筛方便，但是会有扩不出来，而酶切验证是正确的
...

前面也尝试过将能P出特别淡的菌液抽质粒酶切，但酶切验证没连上
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9楼2016-03-23 13:50:20
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小秀子子

新虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by wj2423311236 at 2016-03-22 19:44:23
你做菌液pcr时挑了几个菌落？

一个板都是挑十个以上的
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10楼2016-03-23 13:52:33
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