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tkl0621金虫 (小有名气)
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培养的多环芳烃细菌，最近送样去北京检测，pcr扩增无果 已有5人参与
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各位同仁，年前培养的以多环芳烃为唯一碳源的细菌，本月初将甘油保存的菌种送去检测，那边告知我出来的结果不理想，干扰峰较多，不易区别，测样公司说是菌种受污染了或者没有纯化好；后面我又划线到固体平板上，包扎牢牢地给他们寄送过去，这次又让我吃惊地是pcr扩增不成功，工作人员说是细菌的细胞壁太厚造成失败了，我也是外行，不太懂这方面的知识，请大家帮我分析下，应该如何做？ 1.png  2.png  3.png  4.png |
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tkl0621
12楼2016-03-22 09:17:58
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1. 从峰图看模板应该是纯的，否则同一位置应该有不同高度的套峰，所以我怀疑技术人员的解释有些问题，至少你这次这个峰图看不出有DNA交叉污染迹象。 2. 技术人员解释说细菌壁太厚没打开，我认为这个解释有一定道理。从峰图看锐利度明显不够，造成这个原因的因素有很多，试剂，反应温度，模板量都有可能。测序公司走样都是模式化的也就是第一个启动cycle的时间可能就是3-5分钟左右，后面的解链时间更短。如果第一次细胞没打开后面可能要到多个循环后细胞才被裂开，最后峰图可能就跑不出来。 3.个人建议你先采用上面网友提到的菌落PCR建议，第一个循环95度用10-15分钟裂细胞从而增加模板浓度。如果能扩出来基本就可以确定是模板量不够导致的。当然菌落PCR也有干扰问题，如果直接PCR还没有结果建议先用95度裂细胞10-15分钟，然后离心取上清DNA做PCR模板减少其它细胞组分干扰。 |
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13楼2016-03-23 04:30:53
21楼2016-06-14 11:38:42
tkl0621
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2楼2016-03-20 13:02:56
416114799
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【答案】应助回帖
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自己培养。买dna提取试剂盒提dna自己pcr，把结果送去测序。现在的公司都乱来的。试剂盒可以用mp的土壤dna提取试剂盒。普通的dna提取专用试剂盒不好提 发自小木虫IOS客户端 |
3楼2016-03-20 13:13:09
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工作人员告诉我说甘油保存的菌里混有杂菌，测序干扰峰很多，不易区分到底是哪个菌种。这个到底应该如何搞定，这家生物公司是北京鼎国生物，也是我师姐推荐给我的。希望你能帮到我，或者指引我到比较正规的公司做，多谢了。 发自小木虫Android客户端 |
6楼2016-03-20 20:42:42
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7楼2016-03-20 22:14:42
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9楼2016-03-21 06:18:24
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10楼2016-03-21 07:23:43
