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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 分类/鉴定 » 培养的多环芳烃细菌，最近送样去北京检测，pcr扩增无果
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匿名

用户注销 (正式写手)
本帖仅楼主可见
11楼2016-03-21 07:24:26
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quiller2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1 PAHs degrader在实验过程中的的确确经常有杂菌
2 正确的做法是在PAHs 平板上长出来后，持续在R2A或者LB平板上分离纯化3-5次，获得的单菌落测试其降解能力，如果依然具有降解能力，就进行保种
3 测序的时候，自己做PCR， TA克隆，然后送去持续。很多人不喜欢用TA克隆测序，而习惯用PCR，我个人认为，这样不好！
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tkl0621 tkl0621
致良知
12楼2016-03-22 09:17:58
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ddyant

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1. 从峰图看模板应该是纯的，否则同一位置应该有不同高度的套峰，所以我怀疑技术人员的解释有些问题，至少你这次这个峰图看不出有DNA交叉污染迹象。
2. 技术人员解释说细菌壁太厚没打开，我认为这个解释有一定道理。从峰图看锐利度明显不够，造成这个原因的因素有很多，试剂，反应温度，模板量都有可能。测序公司走样都是模式化的也就是第一个启动cycle的时间可能就是3-5分钟左右，后面的解链时间更短。如果第一次细胞没打开后面可能要到多个循环后细胞才被裂开，最后峰图可能就跑不出来。
3.个人建议你先采用上面网友提到的菌落PCR建议，第一个循环95度用10-15分钟裂细胞从而增加模板浓度。如果能扩出来基本就可以确定是模板量不够导致的。当然菌落PCR也有干扰问题，如果直接PCR还没有结果建议先用95度裂细胞10-15分钟，然后离心取上清DNA做PCR模板减少其它细胞组分干扰。
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tkl0621
好好学习，天天向上，做个合格的搬砖人
13楼2016-03-23 04:30:53
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tkl0621

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
13楼: Originally posted by ddyant at 2016-03-23 04:30:53
1. 从峰图看模板应该是纯的，否则同一位置应该有不同高度的套峰，所以我怀疑技术人员的解释有些问题，至少你这次这个峰图看不出有DNA交叉污染迹象。
2. 技术人员解释说细菌壁太厚没打开，我认为这个解释有一定道理 ...

非常感谢，好专业的回答

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14楼2016-03-23 21:25:37
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tkl0621

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
12楼: Originally posted by quiller2000 at 2016-03-22 09:17:58
1 PAHs degrader在实验过程中的的确确经常有杂菌
2 正确的做法是在PAHs 平板上长出来后，持续在R2A或者LB平板上分离纯化3-5次，获得的单菌落测试其降解能力，如果依然具有降解能力，就进行保种
3 测序的时候，自己 ...

谢谢，值得学习

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15楼2016-03-23 21:26:24
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小落落1929

新虫 (正式写手)
请问多环芳烃分子的尺寸是多少  指大致的长宽高

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16楼2016-05-13 19:21:44
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tkl0621

金虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 小落落1929 at 2016-05-13 19:21:44
请问多环芳烃分子的尺寸是多少  指大致的长宽高

溶解到丙酮是看不到的，如果是固体颗粒的话，大概是在1～1.5mm左右

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17楼2016-05-14 13:47:14
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小落落1929

新虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by tkl0621 at 2016-05-14 13:47:14
溶解到丙酮是看不到的，如果是固体颗粒的话，大概是在1～1.5mm左右
...

不是颗粒 是一个分子的大小   你知道吗？求赐教

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18楼2016-05-14 21:04:32
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tkl0621

金虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 小落落1929 at 2016-05-14 21:04:32
不是颗粒 是一个分子的大小   你知道吗？求赐教
...

对不起，这么晚才回复你，我也不太清楚的
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19楼2016-05-30 11:27:13
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海阔天空-123

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

您好！我们可以帮助您对接检测
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20楼2016-06-08 11:25:22
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