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tkl0621

金虫 (小有名气)

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专业: 环境污染化学

[求助] 培养的多环芳烃细菌，最近送样去北京检测，pcr扩增无果已有5人参与

各位同仁，年前培养的以多环芳烃为唯一碳源的细菌，本月初将甘油保存的菌种送去检测，那边告知我出来的结果不理想，干扰峰较多，不易区别，测样公司说是菌种受污染了或者没有纯化好；后面我又划线到固体平板上，包扎牢牢地给他们寄送过去，这次又让我吃惊地是pcr扩增不成功，工作人员说是细菌的细胞壁太厚造成失败了，我也是外行，不太懂这方面的知识，请大家帮我分析下，应该如何做？

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1楼 2016-03-20 13:01:36

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ddyant

铁虫 (小有名气)

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专业: 环境微生物学

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

1. 从峰图看模板应该是纯的，否则同一位置应该有不同高度的套峰，所以我怀疑技术人员的解释有些问题，至少你这次这个峰图看不出有DNA交叉污染迹象。
2. 技术人员解释说细菌壁太厚没打开，我认为这个解释有一定道理。从峰图看锐利度明显不够，造成这个原因的因素有很多，试剂，反应温度，模板量都有可能。测序公司走样都是模式化的也就是第一个启动cycle的时间可能就是3-5分钟左右，后面的解链时间更短。如果第一次细胞没打开后面可能要到多个循环后细胞才被裂开，最后峰图可能就跑不出来。
3.个人建议你先采用上面网友提到的菌落PCR建议，第一个循环95度用10-15分钟裂细胞从而增加模板浓度。如果能扩出来基本就可以确定是模板量不够导致的。当然菌落PCR也有干扰问题，如果直接PCR还没有结果建议先用95度裂细胞10-15分钟，然后离心取上清DNA做PCR模板减少其它细胞组分干扰。