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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » ET/Red重组系统
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i760912798

木虫 (正式写手)

[交流] ET/Red重组系统 已有2人参与

使用ET/Red重组系统，扩增同源重组片段，连T载体后测序验证，同源臂序列突变很多，是怎么回事，怎样避免同源臂突变呢？如果无法避免同源臂序列突变，突变几个不影响同源重组效率呢？
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1楼 2016-03-13 09:23:26
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安静de执着14

新虫 (著名写手)
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你这是要用Red重组敲除目的基因吗？之前我做过敲除，同源臂扩增后直接用于同源重组，并没有再进行测序。只要你的同源臂在40-60bp左右，重组应该没问题。

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2楼2016-03-13 09:53:12
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i760912798

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 安静de执着14 at 2016-03-13 11:17:12
60bp taq酶  没测序，基因缺失以后再测序的。
...

我也是首次利用red重组系统敲除基因，已经1个多月了，一点进展也没有，就是卡到重组片段上了。你用普通taq酶扩增重组片段后就成功了缺失基因了，你是怎么做到的？

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6楼2016-03-13 11:29:46
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安静de执着14

新虫 (著名写手)
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其实 重组不成功原因很多，比如你感受态做的不好，或者转化方法不当等。

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7楼2016-03-13 11:34:44
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wang2568

银虫 (小有名气)
★
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同源重组一般不会发生突变吧，你是不引物有问题或测序结果双峰了，对照一下峰图啊

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2016-03-13 10:07:53
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i760912798

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 安静de执着14 at 2016-03-13 09:53:12
你这是要用Red重组敲除目的基因吗？之前我做过敲除，同源臂扩增后直接用于同源重组，并没有再进行测序。只要你的同源臂在40-60bp左右，重组应该没问题。

我用的是长引物扩增同源臂和抗性基因的，用的是普通的taq酶，连T载体测序，同源臂有突变，将pcr产物直接电转后涂板也没有克隆长出，你们用的同源臂多大，用什么酶扩的，存在突变吗？

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4楼2016-03-13 10:55:50
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安静de执着14

新虫 (著名写手)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by i760912798 at 2016-03-13 10:55:50
我用的是长引物扩增同源臂和抗性基因的，用的是普通的taq酶，连T载体测序，同源臂有突变，将pcr产物直接电转后涂板也没有克隆长出，你们用的同源臂多大，用什么酶扩的，存在突变吗？
...

60bp taq酶  没测序，基因缺失以后再测序的。

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5楼2016-03-13 11:17:12
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i760912798

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 安静de执着14 at 2016-03-13 11:34:44
其实 重组不成功原因很多，比如你感受态做的不好，或者转化方法不当等。

你用什么重组质粒？我是参考感受态细胞和转化方案做的，应该没有错！

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8楼2016-03-13 11:47:42
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安静de执着14

新虫 (著名写手)
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8楼: Originally posted by i760912798 at 2016-03-13 11:47:42
你用什么重组质粒？我是参考感受态细胞和转化方案做的，应该没有错！
...

pKD46. 同源臂扩增的是pKD3的抗性基因

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9楼2016-03-13 11:52:31
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安静de执着14

新虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by i760912798 at 2016-03-13 11:47:42
你用什么重组质粒？我是参考感受态细胞和转化方案做的，应该没有错！
...

你用的化转还是电转，化转效率较低，你的PCR产物纯化了吗？

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10楼2016-03-13 11:55:02
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