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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » ET/Red重组系统
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i760912798

木虫 (正式写手)
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9楼: Originally posted by 安静de执着14 at 2016-03-13 11:52:31
pKD46. 同源臂扩增的是pKD3的抗性基因
...

我用的不是这个重组质粒，你设计的引物组成是同源序列加抗性基因引物吗？引物中加酶切位点了吗？

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11楼2016-03-13 11:56:51
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i760912798

木虫 (正式写手)
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10楼: Originally posted by 安静de执着14 at 2016-03-13 11:55:02
你用的化转还是电转，化转效率较低，你的PCR产物纯化了吗？
...

电转，胶回收pcr产物

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12楼2016-03-13 11:58:53
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安静de执着14

新虫 (著名写手)
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12楼: Originally posted by i760912798 at 2016-03-13 11:58:53
电转，胶回收pcr产物
...

你的重组质粒是什么质粒？用的什么诱导剂？抗生素是什么？浓度是多少？培养温度是多少？电转完摇床培养没有？
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13楼2016-03-13 12:03:26
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i760912798

木虫 (正式写手)
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10楼: Originally posted by 安静de执着14 at 2016-03-13 11:55:02
你用的化转还是电转，化转效率较低，你的PCR产物纯化了吗？
...

你一般将多少ng的线性片段加到多大体积的电转感受态细胞中转化？另外，重组成功后，一般在抗性平板上能长多少阳性克隆呢？

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14楼2016-03-13 12:08:38
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i760912798

木虫 (正式写手)
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13楼: Originally posted by 安静de执着14 at 2016-03-13 12:03:26
你的重组质粒是什么质粒？用的什么诱导剂？抗生素是什么？浓度是多少？培养温度是多少？电转完摇床培养没有？...

我认为不是质粒的问题，诱导剂不就是阿拉伯糖吗？温度是37,摇床复苏！

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15楼2016-03-13 12:14:34
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安静de执着14

新虫 (著名写手)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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14楼: Originally posted by i760912798 at 2016-03-13 12:08:38
你一般将多少ng的线性片段加到多大体积的电转感受态细胞中转化？另外，重组成功后，一般在抗性平板上能长多少阳性克隆呢？
...

一般至少100ng，100ul感受态细胞，重组后抗性平板长出的阳性克隆与敲除的基因长度有关，基因越长，长出的阳性克隆越少。
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16楼2016-03-13 12:16:59
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安静de执着14

新虫 (著名写手)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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15楼: Originally posted by i760912798 at 2016-03-13 12:14:34
我认为不是质粒的问题，诱导剂不就是阿拉伯糖吗？温度是37,摇床复苏！
...

L-阿拉伯糖不能高温灭菌，只能过滤除菌。我不知道你用的什么重组质粒，重组质粒导入细菌后，是37℃培养的吗？你的温度敏感型质粒吗？37℃培养，重组质粒不丢失吗？
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17楼2016-03-13 12:21:42
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i760912798

木虫 (正式写手)
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10楼: Originally posted by 安静de执着14 at 2016-03-13 11:55:02
你用的化转还是电转，化转效率较低，你的PCR产物纯化了吗？
...

你pcr扩增同源重组片段条件是怎么设置的？

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18楼2016-03-13 13:19:59
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i760912798

木虫 (正式写手)
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10楼: Originally posted by 安静de执着14 at 2016-03-13 11:55:02
你用的化转还是电转，化转效率较低，你的PCR产物纯化了吗？
...

用于ET/Red重组系统的L-阿拉伯糖配制及保存问题，我配制的10%的L-阿拉伯糖溶液，可以分装到离心管中-20℃保存，还是现配现用？
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19楼2016-03-20 16:48:30
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