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i760912798

木虫 (正式写手)

[交流] ET/Red重组系统 已有2人参与

使用ET/Red重组系统,扩增同源重组片段,连T载体后测序验证,同源臂序列突变很多,是怎么回事,怎样避免同源臂突变呢?如果无法避免同源臂序列突变,突变几个不影响同源重组效率呢?
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安静de执着14

新虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
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8楼: Originally posted by i760912798 at 2016-03-13 11:47:42
你用什么重组质粒?我是参考感受态细胞和转化方案做的,应该没有错!
...

pKD46. 同源臂扩增的是pKD3的抗性基因

发自小木虫Android客户端
9楼2016-03-13 11:52:31
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安静de执着14

新虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你这是要用Red重组敲除目的基因吗?之前我做过敲除,同源臂扩增后直接用于同源重组,并没有再进行测序。只要你的同源臂在40-60bp左右,重组应该没问题。

发自小木虫Android客户端
2楼2016-03-13 09:53:12
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wang2568

银虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
同源重组一般不会发生突变吧,你是不引物有问题或测序结果双峰了,对照一下峰图啊

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
3楼2016-03-13 10:07:53
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i760912798

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 安静de执着14 at 2016-03-13 09:53:12
你这是要用Red重组敲除目的基因吗?之前我做过敲除,同源臂扩增后直接用于同源重组,并没有再进行测序。只要你的同源臂在40-60bp左右,重组应该没问题。

我用的是长引物扩增同源臂和抗性基因的,用的是普通的taq酶,连T载体测序,同源臂有突变,将pcr产物直接电转后涂板也没有克隆长出,你们用的同源臂多大,用什么酶扩的,存在突变吗?

发自小木虫Android客户端
4楼2016-03-13 10:55:50
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