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kingjazz23金虫 (小有名气)
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CRISPR/Cas系列问题 已有1人参与
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您们好，今年研一下学期老板打算做CRISPR/Cas，叫我查查问题，我们打算做酵母的CRISPR/Cas，看了几篇文献，有些问题不是很懂，所以想问问你们： （1）在paper中经常会看到一个a premature stop codon，想问问他有什么作用，一般看到都是用研究人员在PAM的位置引入的，不太清楚他们的意图是什么？ （2）经常在paper中看到gRNA cassette和plasmid，我知道plasmid是质粒的意思，而前面那个cassette不太清楚是什么意思，在DiCarlo的一篇文献中，他提到了两种gRNA的表达方法，一个是gRNA PCR cassette还有一个是gRNA plasmid，这两个到底有什么区别？ （3）经常在文章中出现的target sequence是存在于gRNA上的那段识别目标DNA的序列还是指含有PAM序列那段序列？ （4）文章中有时候会出现的tRNA是指tracrRNA吗？ （5）同样是在DiCarlo那篇文献中，其中有一句话是Donor DNA was designed to recombine within the gRNA CAN1.Y genomic target using homology arms to the site， 想问问这句话是什么意思？Donor DNA不是应该与基因组序列配对吗？通过同源臂进行修复，达到替换的效果，这里为什么说是与gRNA结合呢? （6）文献中常常出现的oligonucleotide是指Donor DNA吗? 以上这些就是本人一些不太理解的地方，希望各路大神帮忙解决一下，谢谢！ |
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26楼2016-03-14 13:51:16
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1.蛋白质翻译起始于atg,终止于三个终止子。如果前面的序列提前突变成终止子就是premature stop codon了。。2.一个表达单元叫cassette，包含启动子cds 发自小木虫Android客户端 |
3楼2016-03-11 21:06:06
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和转录终止。一个pcr片段包含U6和sgrna序列就可以转染到细胞里短暂表达sgrna。也可以克隆到质粒里瞬时转染细胞表达。3.target位点都必须含有pam，sgrna根据target位点来的，但是一定不含pam序列。4.不是。5.grna作用是识别目标，cas9切割识别位点。donor是同源重组模板。6.引物就是一段oligonucleotide.ssODN就是一段oligonucleotide，因为可以作为同源重组模板经常被提到 发自小木虫Android客户端 |
5楼2016-03-11 21:15:57
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第六个问题还是不是很懂，作为同源重组模板的不是叫Donor DNA吗?我觉得这里的oligonucleotide应该也是指转进去的Donor DNA吧，还有一个问题不是很懂，也是在DiCarlo那篇文献里面的一句话“A double strand 90 mer oligonucleotide donor centred around the PAM sequence contained 2bp changes to mutate the PAM sequence and incorporate a premature TAG stop codon”他这里用的90BP的寡核苷酸供体应该是用来突变那个PAM序列的吧，让他变成一个premature stop codon?这样做是为了敲除？ |
10楼2016-03-11 22:10:09
