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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » CRISPR/Cas系列问题
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kingjazz23

金虫 (小有名气)

[求助] CRISPR/Cas系列问题 已有1人参与

您们好，今年研一下学期老板打算做CRISPR/Cas，叫我查查问题，我们打算做酵母的CRISPR/Cas，看了几篇文献，有些问题不是很懂，所以想问问你们：
（1）在paper中经常会看到一个a premature stop codon，想问问他有什么作用，一般看到都是用研究人员在PAM的位置引入的，不太清楚他们的意图是什么？
（2）经常在paper中看到gRNA cassette和plasmid，我知道plasmid是质粒的意思，而前面那个cassette不太清楚是什么意思，在DiCarlo的一篇文献中，他提到了两种gRNA的表达方法，一个是gRNA PCR cassette还有一个是gRNA plasmid，这两个到底有什么区别？
（3）经常在文章中出现的target sequence是存在于gRNA上的那段识别目标DNA的序列还是指含有PAM序列那段序列？
（4）文章中有时候会出现的tRNA是指tracrRNA吗？
（5）同样是在DiCarlo那篇文献中，其中有一句话是Donor DNA was designed to recombine within the gRNA CAN1.Y genomic target using homology arms to the site，
想问问这句话是什么意思？Donor DNA不是应该与基因组序列配对吗？通过同源臂进行修复，达到替换的效果，这里为什么说是与gRNA结合呢?
（6）文献中常常出现的oligonucleotide是指Donor DNA吗?

以上这些就是本人一些不太理解的地方，希望各路大神帮忙解决一下，谢谢！
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1楼 2016-03-11 17:17:53
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Bioexperixgs

新虫 (正式写手)
引用回帖:
25楼: Originally posted by Jena_fungus at 2016-03-14 12:35:40
请问一下这篇文章题目是？...

A Candida albicans CRISPR system permits genetic engineering of essential genes and gene families
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26楼2016-03-14 13:51:16
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普通回帖

王继楼马

新虫 (小有名气)
已关注这个问题，目前课题涉及CRISPR-CAS9，原理还是懂，先推荐楼主看中文的说明再去看英文的文献，会好很多。因为很多概念你只有中文才能理解透彻。抱歉先关注，这两天闲下来的时候再共同讨论。
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2楼2016-03-11 20:52:54
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ken19860823

木虫 (正式写手)
1.蛋白质翻译起始于atg,终止于三个终止子。如果前面的序列提前突变成终止子就是premature stop codon了。。2.一个表达单元叫cassette，包含启动子cds

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做基因修饰的老菜鸡
3楼2016-03-11 21:06:06
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happykings

木虫 (正式写手)
可以交流，我也正想做

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4楼2016-03-11 21:09:48
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ken19860823

木虫 (正式写手)
和转录终止。一个pcr片段包含U6和sgrna序列就可以转染到细胞里短暂表达sgrna。也可以克隆到质粒里瞬时转染细胞表达。3.target位点都必须含有pam，sgrna根据target位点来的，但是一定不含pam序列。4.不是。5.grna作用是识别目标，cas9切割识别位点。donor是同源重组模板。6.引物就是一段oligonucleotide.ssODN就是一段oligonucleotide，因为可以作为同源重组模板经常被提到

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做基因修饰的老菜鸡
5楼2016-03-11 21:15:57
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kingjazz23

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 王继楼马 at 2016-03-11 20:52:54
已关注这个问题，目前课题涉及CRISPR-CAS9，原理还是懂，先推荐楼主看中文的说明再去看英文的文献，会好很多。因为很多概念你只有中文才能理解透彻。抱歉先关注，这两天闲下来的时候再共同讨论。

中文说明具体指什么？中文的文献还是那些公司的指南？其实我看英文文献前已经看了几篇中文的review，但是感觉讲得还是浅
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6楼2016-03-11 21:18:19
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kingjazz23

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ken19860823 at 2016-03-11 21:06:06
1.蛋白质翻译起始于atg,终止于三个终止子。如果前面的序列提前突变成终止子就是premature stop codon了。。2.一个表达单元叫cassette，包含启动子cds

那他为什么要引入一个premature stop codon呢？是为了只想让翻译的时候翻译到PAM的前一段序列吗？这样做有什么意义？
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7楼2016-03-11 21:21:15
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ken19860823

木虫 (正式写手)
knockout 啊，

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做基因修饰的老菜鸡
8楼2016-03-11 21:22:59
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王继楼马

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by kingjazz23 at 2016-03-11 21:18:19
中文说明具体指什么？中文的文献还是那些公司的指南？其实我看英文文献前已经看了几篇中文的review，但是感觉讲得还是浅...

有专门介绍这个技术的，基础的和比较深的都有。不过既然你已经看过了，我觉得就不说了。请问你看的是哪一篇文献？可以发个题目么？抽空我也去看一看。另外，我感觉你第五条是不是理解错了。Donor DNA是用来基因重组的target的。
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9楼2016-03-11 21:57:33
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kingjazz23

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ken19860823 at 2016-03-11 21:15:57
和转录终止。一个pcr片段包含U6和sgrna序列就可以转染到细胞里短暂表达sgrna。也可以克隆到质粒里瞬时转染细胞表达。3.target位点都必须含有pam，sgrna根据target位点来的，但是一定不含pam序列。4.不是。5.grna作用 ...

第六个问题还是不是很懂，作为同源重组模板的不是叫Donor DNA吗?我觉得这里的oligonucleotide应该也是指转进去的Donor DNA吧，还有一个问题不是很懂，也是在DiCarlo那篇文献里面的一句话“A double strand 90 mer oligonucleotide donor centred around the PAM sequence contained 2bp changes to mutate the PAM sequence and incorporate a premature TAG stop codon”他这里用的90BP的寡核苷酸供体应该是用来突变那个PAM序列的吧，让他变成一个premature stop codon?这样做是为了敲除？
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10楼2016-03-11 22:10:09
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