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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求大神指教！！！
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小学生55555

新虫 (初入文坛)

[求助] 求大神指教！！！ 已有1人参与

P一个基因，大约600多bp.从一个质粒P下来并加入一个酶切位点，用的酶是Pfu保真酶，做了30循环。退火温度也恰当。刚开始能P出来，但量特别少，后来就P不出来了，谁能告诉是怎么一回事啊，无限郁闷啊！！！

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1楼 2016-03-11 09:08:58
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小学生55555

新虫 (初入文坛)
帮帮忙吧！

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2楼2016-03-11 09:22:19
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卡维斯

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR这个实验本身就有很多不确定因素。
对于你的实验描述来说“刚开始能P出来，但量特别少”，一般质粒扩增是最容易的，这可能是你的质粒模板浓度太低或者是降解了？，建议重新提取质粒。
“后来就P不出来了“ 引物质量？酶保存？Pfu酶在使用时最好不要加入太多的引物。
以上都没有问题那尝试一下touch-down程序或者设置梯度优化退火。
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3楼2016-03-11 10:11:09
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安静de执着14

新虫 (著名写手)
正如楼上所言，不确定因素太多了，除了楼上所说的，还有其他因素，比如你在配制反应体系的时候有没有漏加，退火温度是否合适？P完以后是立刻跑胶还是放置时间太长DNA降解呢？

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4楼2016-03-11 10:20:20
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小学生55555

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-11 10:11:09
PCR这个实验本身就有很多不确定因素。
对于你的实验描述来说“刚开始能P出来，但量特别少”，一般质粒扩增是最容易的，这可能是你的质粒模板浓度太低或者是降解了？，建议重新提取质粒。
“后来就P不出来了“ 引物 ...

谢谢，我再好好筛查一下个个条件

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5楼2016-03-11 18:32:09
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