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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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小学生55555

新虫 (初入文坛)

[求助] 求大神指教!!! 已有1人参与

P一个基因,大约600多bp.从一个质粒P下来并加入一个酶切位点,用的酶是Pfu保真酶,做了30循环。退火温度也恰当。刚开始能P出来,但量特别少,后来就P不出来了,谁能告诉是怎么一回事啊,无限郁闷啊!!!

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安静de执着14

新虫 (著名写手)

正如楼上所言,不确定因素太多了,除了楼上所说的,还有其他因素,比如你在配制反应体系的时候有没有漏加,退火温度是否合适?P完以后是立刻跑胶还是放置时间太长DNA降解呢?

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4楼2016-03-11 10:20:20
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小学生55555

新虫 (初入文坛)

2楼2016-03-11 09:22:19
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卡维斯

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
PCR这个实验本身就有很多不确定因素。
对于你的实验描述来说“刚开始能P出来,但量特别少”,一般质粒扩增是最容易的,这可能是你的质粒模板浓度太低或者是降解了?,建议重新提取质粒。
“后来就P不出来了“ 引物质量?酶保存?Pfu酶在使用时最好不要加入太多的引物。
以上都没有问题那尝试一下touch-down程序或者设置梯度优化退火。
3楼2016-03-11 10:11:09
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小学生55555

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-11 10:11:09
PCR这个实验本身就有很多不确定因素。
对于你的实验描述来说“刚开始能P出来,但量特别少”,一般质粒扩增是最容易的,这可能是你的质粒模板浓度太低或者是降解了?,建议重新提取质粒。
“后来就P不出来了“ 引物 ...

谢谢,我再好好筛查一下个个条件

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5楼2016-03-11 18:32:09
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