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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 高拷贝质粒变成低拷贝，可能吗？！
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kaka369

新虫 (小有名气)

[求助] 高拷贝质粒变成低拷贝，可能吗？！ 已有1人参与

最近用pGEM T-easy 构建了一个载体（在多克隆位点区插入大约4kb片段），总长度大约7KB，这个载体转入DH5a能狗很好的提取质粒，，5ML菌液可以提取50ul质粒，浓度达到468ng/ul， 实验室用的是OMEGA 质粒小提盒子，可是当我双酶切插入GFP（大约800bp）， 获得阳性克隆，提取质粒的时候遇到问题了，，质粒却成了低拷贝，用5ml菌液最后浓度才10ng/ul, 我跟空载体同时做，发现空载体可以提的很好 （说明试剂盒没有问题），就是插入片段的质粒菌，浓度很低。这是什么原因？
推测：质粒太长？！不太可能
          DH5a菌株有问题？造成裂解有问题？！
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1楼 2016-03-11 05:26:39
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ken19860823

木虫 (正式写手)
菌落pcr结果可以发来看看，然后楼主扩了几个阳性克隆

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做基因修饰的老菜鸡
2楼2016-03-11 08:10:36
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kaka369

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ken19860823 at 2016-03-11 08:10:36
菌落pcr结果可以发来看看，然后楼主扩了几个阳性克隆

我挑了8个克隆，全部检测阳性。而且测序确实已经插进去了。。但是就是低拷贝了。。。。是菌的问题还是质粒的问题！？
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3楼2016-03-11 10:02:19
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ken19860823

木虫 (正式写手)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-03-15 08:54:32
引用回帖:
3楼: Originally posted by kaka369 at 2016-03-11 10:02:19
我挑了8个克隆，全部检测阳性。而且测序确实已经插进去了。。但是就是低拷贝了。。。。是菌的问题还是质粒的问题！？...

有的时候会出现质粒少的问题，不过看你什么作用，10ng每微升有点太小，跑胶都难看出来。应该不是拷贝的问题，就算一个拷贝都不能那么低啊。质粒低个五倍左右算极限了，一般这样只要浓缩一下就行，只要测序正确，中间的问题一般可以忽略。这里就是你10ng/ul测序都测不动啊，测序至少50ng/ul的。楼主还是得给多一点有用信息。（我做过测序）
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做基因修饰的老菜鸡
4楼2016-03-11 12:12:47
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kaka369

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ken19860823 at 2016-03-11 12:12:47
有的时候会出现质粒少的问题，不过看你什么作用，10ng每微升有点太小，跑胶都难看出来。应该不是拷贝的问题，就算一个拷贝都不能那么低啊。质粒低个五倍左右算极限了，一般这样只要浓缩一下就行，只要测序正确，中 ...

没有的，测序的浓度30ng/ul，就会给你测出来的。浓度再小，也可以侧，只不过背景信号很高，容易给你侧错或者出现N的情况~~你感觉是不是菌株的问题？！
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5楼2016-03-15 02:59:41
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ken19860823

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by kaka369 at 2016-03-15 02:59:41
没有的，测序的浓度30ng/ul，就会给你测出来的。浓度再小，也可以侧，只不过背景信号很高，容易给你侧错或者出现N的情况~~你感觉是不是菌株的问题？！...

菌株没问题，复制起点没突变我觉得都不会是菌株的问题。测序之前都要定量的，我们公司比较穷，都是肉眼定量的。我之前在武汉做的时候不会测50ng/ul以下的。因为公司有规定，返工成功率不能低于百分之85，这种明显写在测序单的硬性指标不会有人去挑战的。摇不起菌来在测序单位碰到的一般是噬菌体感染，如果你其他菌都没问题的话重新做一次吧，分子生物多做几次就知道哪里出问题了。
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做基因修饰的老菜鸡
6楼2016-03-15 09:16:00
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BAC 文库

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

质粒的拷贝数是有复制启始子和菌株决定的，一般情况下不会受插入片段的影响，除非你的插入片段中包括另外一个启动子或者致死基因等。GEM T-easy 是一类多功能型高拷贝载体，你尝试着划线纯化一下菌落，有很大可能是菌不纯导致的。
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7楼2016-03-22 09:11:25
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kaka369

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by BAC 文库 at 2016-03-22 09:11:25
质粒的拷贝数是有复制启始子和菌株决定的，一般情况下不会受插入片段的影响，除非你的插入片段中包括另外一个启动子或者致死基因等。GEM T-easy 是一类多功能型高拷贝载体，你尝试着划线纯化一下菌落，有很大可能是 ...

原因已经找到了，重新制备的感受态（菌株用的别的实验室的），现在5ml菌液可以提到400ng/ul, ~~感觉就是感受态的问题，，，果不其然~~
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8楼2016-03-22 11:36:33
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15761622115

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by kaka369 at 2016-03-22 04:36:33
原因已经找到了，重新制备的感受态（菌株用的别的实验室的），现在5ml菌液可以提到400ng/ul, ~~感觉就是感受态的问题，，，果不其然~~...

你好，我现在也遇到相似的问题。DH5α转化pcDNA6/TR,转化后转化子、摇菌都很正常，就是提质粒的时候浓度特别低，别的质粒同样的条件，浓度挺高的。我重新转化了一次还是不行，摇床时间、菌量都改过，都不行。但是还没换过感受态，用的都是同一批感受态，看到你说的重新制备感受态，我想问一下是不是我的感受态出问题了，但是为什么别的质粒就可以提成功
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9楼2019-04-28 07:54:57
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