应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 高拷贝质粒变成低拷贝，可能吗？！
91/1返回列表
查看: 4147  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

kaka369

新虫 (小有名气)

[求助] 高拷贝质粒变成低拷贝，可能吗？！ 已有1人参与

最近用pGEM T-easy 构建了一个载体（在多克隆位点区插入大约4kb片段），总长度大约7KB，这个载体转入DH5a能狗很好的提取质粒，，5ML菌液可以提取50ul质粒，浓度达到468ng/ul， 实验室用的是OMEGA 质粒小提盒子，可是当我双酶切插入GFP（大约800bp）， 获得阳性克隆，提取质粒的时候遇到问题了，，质粒却成了低拷贝，用5ml菌液最后浓度才10ng/ul, 我跟空载体同时做，发现空载体可以提的很好 （说明试剂盒没有问题），就是插入片段的质粒菌，浓度很低。这是什么原因？
推测：质粒太长？！不太可能
          DH5a菌株有问题？造成裂解有问题？！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
1楼 2016-03-11 05:26:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ken19860823

木虫 (正式写手)
菌落pcr结果可以发来看看，然后楼主扩了几个阳性克隆

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
做基因修饰的老菜鸡
2楼2016-03-11 08:10:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kaka369

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ken19860823 at 2016-03-11 08:10:36
菌落pcr结果可以发来看看，然后楼主扩了几个阳性克隆

我挑了8个克隆，全部检测阳性。而且测序确实已经插进去了。。但是就是低拷贝了。。。。是菌的问题还是质粒的问题！？
赞一下 回复此楼
3楼2016-03-11 10:02:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ken19860823

木虫 (正式写手)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-03-15 08:54:32
引用回帖:
3楼: Originally posted by kaka369 at 2016-03-11 10:02:19
我挑了8个克隆，全部检测阳性。而且测序确实已经插进去了。。但是就是低拷贝了。。。。是菌的问题还是质粒的问题！？...

有的时候会出现质粒少的问题，不过看你什么作用，10ng每微升有点太小，跑胶都难看出来。应该不是拷贝的问题，就算一个拷贝都不能那么低啊。质粒低个五倍左右算极限了，一般这样只要浓缩一下就行，只要测序正确，中间的问题一般可以忽略。这里就是你10ng/ul测序都测不动啊，测序至少50ng/ul的。楼主还是得给多一点有用信息。（我做过测序）
赞一下(1人) 回复此楼
做基因修饰的老菜鸡
4楼2016-03-11 12:12:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kaka369

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ken19860823 at 2016-03-11 12:12:47
有的时候会出现质粒少的问题，不过看你什么作用，10ng每微升有点太小，跑胶都难看出来。应该不是拷贝的问题，就算一个拷贝都不能那么低啊。质粒低个五倍左右算极限了，一般这样只要浓缩一下就行，只要测序正确，中 ...

没有的，测序的浓度30ng/ul，就会给你测出来的。浓度再小，也可以侧，只不过背景信号很高，容易给你侧错或者出现N的情况~~你感觉是不是菌株的问题？！
赞一下 回复此楼
5楼2016-03-15 02:59:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ken19860823

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by kaka369 at 2016-03-15 02:59:41
没有的，测序的浓度30ng/ul，就会给你测出来的。浓度再小，也可以侧，只不过背景信号很高，容易给你侧错或者出现N的情况~~你感觉是不是菌株的问题？！...

菌株没问题，复制起点没突变我觉得都不会是菌株的问题。测序之前都要定量的，我们公司比较穷，都是肉眼定量的。我之前在武汉做的时候不会测50ng/ul以下的。因为公司有规定，返工成功率不能低于百分之85，这种明显写在测序单的硬性指标不会有人去挑战的。摇不起菌来在测序单位碰到的一般是噬菌体感染，如果你其他菌都没问题的话重新做一次吧，分子生物多做几次就知道哪里出问题了。
赞一下(1人) 回复此楼
做基因修饰的老菜鸡
6楼2016-03-15 09:16:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

BAC 文库

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

质粒的拷贝数是有复制启始子和菌株决定的，一般情况下不会受插入片段的影响，除非你的插入片段中包括另外一个启动子或者致死基因等。GEM T-easy 是一类多功能型高拷贝载体，你尝试着划线纯化一下菌落，有很大可能是菌不纯导致的。
赞一下 回复此楼
7楼2016-03-22 09:11:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kaka369

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by BAC 文库 at 2016-03-22 09:11:25
质粒的拷贝数是有复制启始子和菌株决定的，一般情况下不会受插入片段的影响，除非你的插入片段中包括另外一个启动子或者致死基因等。GEM T-easy 是一类多功能型高拷贝载体，你尝试着划线纯化一下菌落，有很大可能是 ...

原因已经找到了，重新制备的感受态（菌株用的别的实验室的），现在5ml菌液可以提到400ng/ul, ~~感觉就是感受态的问题，，，果不其然~~
赞一下 回复此楼
8楼2016-03-22 11:36:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

15761622115

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by kaka369 at 2016-03-22 04:36:33
原因已经找到了，重新制备的感受态（菌株用的别的实验室的），现在5ml菌液可以提到400ng/ul, ~~感觉就是感受态的问题，，，果不其然~~...

你好，我现在也遇到相似的问题。DH5α转化pcDNA6/TR,转化后转化子、摇菌都很正常，就是提质粒的时候浓度特别低，别的质粒同样的条件，浓度挺高的。我重新转化了一次还是不行，摇床时间、菌量都改过，都不行。但是还没换过感受态，用的都是同一批感受态，看到你说的重新制备感受态，我想问一下是不是我的感受态出问题了，但是为什么别的质粒就可以提成功
赞一下 回复此楼
9楼2019-04-28 07:54:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 kaka369 的主题更新
91/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿武理085500机械专业总分300求调剂 +3 an10101 2026-03-24 7/350 2026-03-25 00:00 by 山鬼0-
[考研] 考研调剂 +4 呼呼？~+123456 2026-03-24 4/200 2026-03-24 23:16 by barlinike
[考研] 0805 316求调剂 +6 大雪深藏 2026-03-18 6/300 2026-03-24 22:13 by peike
[考研] 求调剂，一志愿:南京航空航天大学大学 ，080500材料科学与工程学硕，总分289分 +5 @taotao 2026-03-19 5/250 2026-03-24 21:07 by greychen00
[考研] 07化学280分求调剂 +6 722865 2026-03-23 6/300 2026-03-24 20:58 by allen-yin
[考研] 299求调剂 +7 某某某某位 2026-03-21 7/350 2026-03-24 15:24 by cuifj
[考研] 0703化学求调剂 +4 奶油草莓. 2026-03-22 5/250 2026-03-23 19:37 by pswait
[考研] 考研化学308分求调剂 +7 你好明天你好 2026-03-23 8/400 2026-03-23 18:39 by macy2011
[考研] 一志愿上海交大生物与医药专硕324分，求调剂 +5 jiajunX 2026-03-22 5/250 2026-03-23 18:07 by YMU施老师
[考研] 一志愿南京理工大学085701资源与环境302分求调剂 +5 葵梓卫队 2026-03-18 7/350 2026-03-23 16:26 by lingjue
[考研] 一志愿 西北大学 ，070300化学学硕，总分287，双非一本，求调剂。 +3 晨昏线与星海 2026-03-20 3/150 2026-03-22 16:00 by ColorlessPI
[考研] 275求调剂 +6 shansx 2026-03-22 8/400 2026-03-22 15:27 by barlinike
[考研] 材料学硕333求调剂 +3 北道巷 2026-03-18 3/150 2026-03-21 18:17 by 学员8dgXkO
[考研] 085601调剂 358分 +3 zzzzggh 2026-03-20 4/200 2026-03-21 10:21 by luoyongfeng
[考研] 一志愿华中科技大学，080502，354分求调剂 +5 守候夕阳CF 2026-03-18 5/250 2026-03-21 01:06 by JourneyLucky
[考研] 考研调剂求学校推荐 +3 伯乐29 2026-03-18 5/250 2026-03-20 22:59 by JourneyLucky
[考研] A区线材料学调剂 +5 周周无极 2026-03-20 5/250 2026-03-20 21:33 by laoshidan
[考研] 295材料求调剂，一志愿武汉理工085601专硕 +5 Charlieyq 2026-03-19 5/250 2026-03-20 20:35 by JourneyLucky
[考研] 086500 325 求调剂 +3 领带小熊 2026-03-19 3/150 2026-03-20 18:38 by 尽舜尧1
[考研] 招收调剂硕士 +4 lidianxing 2026-03-19 12/600 2026-03-20 12:25 by lidianxing
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭