应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 高拷贝质粒变成低拷贝，可能吗？！
51/1返回列表
查看: 4426  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

kaka369

新虫 (小有名气)

[求助] 高拷贝质粒变成低拷贝，可能吗？！ 已有1人参与

最近用pGEM T-easy 构建了一个载体（在多克隆位点区插入大约4kb片段），总长度大约7KB，这个载体转入DH5a能狗很好的提取质粒，，5ML菌液可以提取50ul质粒，浓度达到468ng/ul， 实验室用的是OMEGA 质粒小提盒子，可是当我双酶切插入GFP（大约800bp）， 获得阳性克隆，提取质粒的时候遇到问题了，，质粒却成了低拷贝，用5ml菌液最后浓度才10ng/ul, 我跟空载体同时做，发现空载体可以提的很好 （说明试剂盒没有问题），就是插入片段的质粒菌，浓度很低。这是什么原因？
推测：质粒太长？！不太可能
          DH5a菌株有问题？造成裂解有问题？！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
1楼 2016-03-11 05:26:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

15761622115

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by kaka369 at 2016-03-22 04:36:33
原因已经找到了，重新制备的感受态（菌株用的别的实验室的），现在5ml菌液可以提到400ng/ul, ~~感觉就是感受态的问题，，，果不其然~~...

你好，我现在也遇到相似的问题。DH5α转化pcDNA6/TR,转化后转化子、摇菌都很正常，就是提质粒的时候浓度特别低，别的质粒同样的条件，浓度挺高的。我重新转化了一次还是不行，摇床时间、菌量都改过，都不行。但是还没换过感受态，用的都是同一批感受态，看到你说的重新制备感受态，我想问一下是不是我的感受态出问题了，但是为什么别的质粒就可以提成功
赞一下 回复此楼
9楼2019-04-28 07:54:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 9 个回答

ken19860823

木虫 (正式写手)
菌落pcr结果可以发来看看，然后楼主扩了几个阳性克隆

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
做基因修饰的老菜鸡
2楼2016-03-11 08:10:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kaka369

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ken19860823 at 2016-03-11 08:10:36
菌落pcr结果可以发来看看，然后楼主扩了几个阳性克隆

我挑了8个克隆，全部检测阳性。而且测序确实已经插进去了。。但是就是低拷贝了。。。。是菌的问题还是质粒的问题！？
赞一下 回复此楼
3楼2016-03-11 10:02:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ken19860823

木虫 (正式写手)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-03-15 08:54:32
引用回帖:
3楼: Originally posted by kaka369 at 2016-03-11 10:02:19
我挑了8个克隆，全部检测阳性。而且测序确实已经插进去了。。但是就是低拷贝了。。。。是菌的问题还是质粒的问题！？...

有的时候会出现质粒少的问题，不过看你什么作用，10ng每微升有点太小，跑胶都难看出来。应该不是拷贝的问题，就算一个拷贝都不能那么低啊。质粒低个五倍左右算极限了，一般这样只要浓缩一下就行，只要测序正确，中间的问题一般可以忽略。这里就是你10ng/ul测序都测不动啊，测序至少50ng/ul的。楼主还是得给多一点有用信息。（我做过测序）
赞一下(1人) 回复此楼
做基因修饰的老菜鸡
4楼2016-03-11 12:12:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 9 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 什么时候开奖？ +10 CrisMessi 2026-08-18 11/550 2026-08-24 06:50 by 开心的小狮子
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +5 炎黄贵胄 2026-08-22 6/300 2026-08-24 06:34 by sincosx
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +11 kulium 2026-08-21 14/700 2026-08-24 02:12 by 流流伤
[基金申请] 2026国自然函评费到账 +16 羊腰板 2026-08-21 17/850 2026-08-23 23:02 by tianxiaochun
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办？ +5 简单化xn 2026-08-22 10/500 2026-08-23 12:38 by 简单化xn
[基金申请] 今天放榜吗？ +15 布布和一二 2026-08-19 16/800 2026-08-23 09:55 by 张春生
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +7 且听虎啸 2026-08-17 8/400 2026-08-22 21:55 by 医学老男孩
[基金申请] 人气不行了 +8 fansofjerry 2026-08-21 8/400 2026-08-22 16:30 by zyqchem
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +16 kkkl_v 2026-08-19 17/850 2026-08-22 16:12 by 阿布Abu
[基金申请] 时间戳今天，20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 放榜前的不淡定 40+4 snowwithsea 2026-08-19 14/700 2026-08-21 23:51 by cratir
[基金申请] 今日不放榜？网传国自然预计 8 月 27 日可查结果 +16 医学老男孩 2026-08-20 20/1000 2026-08-21 21:13 by Ldrop2023
[基金申请] 看来今天不会放榜了？ +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[基金申请] 我面上完蛋了 +7 且听虎啸 2026-08-20 8/400 2026-08-21 12:31 by 酷酷墨镜
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧？ +4 哈哈蛤？ 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +18 基诺咪客 2026-08-17 23/1150 2026-08-20 17:19 by Godzela
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭