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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 融合PCR 融合出现问题，无法出条带
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chengjie0801

新虫 (初入文坛)

[交流] 融合PCR 融合出现问题，无法出条带

我的三段DNA片段大小为330bp, 2360bp, 305bp. 已用引物分别扩增出这三段。融合时大片段在中间，小片段两边，小片段与大片段的重合序列长度分别为20， 30bp。 我使用的条件是
10 X AccuPrime Reaction mix*                2 ul
Purified end fragments                        2 ul
Selectable marker DNA                        1 ul (100-200 ng)
AccuPrime Pfx polymerase (2.5 U/l)        0.16 ul
H2O (sterile, dd/ultrapure)                        14.86 ul
Thermal cycles
        denature        94 C – 2 min
        cycle (x35)        94 C, 30s - 50 C,30s– 68C, 3min
        finish                68 C, 10 min
出来的结果如图step1,
然后进行PCR 扩增条件如下
VT = 50 l

10 X AccuPrime Reaction mix*                        5 l
Forward (sense) primer (5 nmoles/ml)                5 l
Reverse primer (antisense) (5 nmoles/ml)        5 l
Fusion reaction                                        2 l
AccuPrime Pfx polymerase (2.5 U/l)                0.4 l (1 unit)
H2O (sterile, dd/ultrapure)                                32.6 l

Thermal cycles
        denature        94C – 2 min
        cycle (x35)        94C, 30s - 50C, 30s – 68 C, 3min
        finish                68C, 10 min
然后出现了如图step2.
因为我使用的DNA片段无法使用酶切所以才用融合PCR。希望各位师兄师姐能帮帮我。

融合PCR 融合出现问题，无法出条带
2016.03.06_16.43.56_Fl-UV.jpg
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1楼 2016-03-10 22:02:59
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生科深似海

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
两两拼接吧   三个一块拼效率低吧

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2楼2016-03-10 22:09:17
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chengjie0801

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 生科深似海 at 2016-03-10 22:09:17
两两拼接吧   三个一块拼效率低吧

请问您这样做过吗？ 还有能帮忙看下我的步骤有什么地方可以改进呢？
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3楼2016-03-10 22:30:33
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生科深似海

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by chengjie0801 at 2016-03-10 22:30:33
请问您这样做过吗？ 还有能帮忙看下我的步骤有什么地方可以改进呢？...

我只做过两两拼接  你的片段不大  应该很好做  三个一块拼接没做过  估计效率会低甚至没有产物

发自小木虫Android客户端
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4楼2016-03-10 22:39:19
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wang2568

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
全长引物量使用正常值，融合引物量降低十分之一试一下。三段效率低，可以两端融合。

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5楼2016-03-11 08:42:06
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chengjie0801

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by wang2568 at 2016-03-11 08:42:06
全长引物量使用正常值，融合引物量降低十分之一试一下。三段效率低，可以两端融合。

好的，我试试，谢谢答复！
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6楼2016-03-11 21:56:56
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sunlk

铜虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
有抹带说明模板太多，模板不要太多。
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很给力
7楼2016-03-12 13:06:11
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chengjie0801

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by sunlk at 2016-03-12 13:06:11
有抹带说明模板太多，模板不要太多。

那请问模板一般控制在多少，或者说模板和引物的比例大约多少？
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8楼2016-03-13 12:00:55
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