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[交流]
融合PCR 融合出现问题，无法出条带
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我的三段DNA片段大小为330bp, 2360bp, 305bp. 已用引物分别扩增出这三段。融合时大片段在中间，小片段两边，小片段与大片段的重合序列长度分别为20， 30bp。 我使用的条件是 10 X AccuPrime Reaction mix* 2 ul Purified end fragments 2 ul Selectable marker DNA 1 ul (100-200 ng) AccuPrime Pfx polymerase (2.5 U/l) 0.16 ul H2O (sterile, dd/ultrapure) 14.86 ul Thermal cycles denature 94 C – 2 min cycle (x35) 94 C, 30s - 50 C,30s– 68C, 3min finish 68 C, 10 min 出来的结果如图step1, 然后进行PCR 扩增条件如下 VT = 50 l 10 X AccuPrime Reaction mix* 5 l Forward (sense) primer (5 nmoles/ml) 5 l Reverse primer (antisense) (5 nmoles/ml) 5 l Fusion reaction 2 l AccuPrime Pfx polymerase (2.5 U/l) 0.4 l (1 unit) H2O (sterile, dd/ultrapure) 32.6 l Thermal cycles denature 94C – 2 min cycle (x35) 94C, 30s - 50C, 30s – 68 C, 3min finish 68C, 10 min 然后出现了如图step2. 因为我使用的DNA片段无法使用酶切所以才用融合PCR。希望各位师兄师姐能帮帮我。  2016.03.06_16.43.56_Fl-UV.jpg |
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