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屁桃粉

新虫 (小有名气)

[求助] 构建重组质粒遇到了问题,请大家帮忙看看~~谢谢~~! 已有2人参与

准备构建pET28a-MAN重组质粒,MAN基因在pUC57载体上,长度1100bp。
现把pET28a和pUC57分别双酶切后跑胶,见图一,分别切下1100bp和5300bp的片段然后用天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收后,再跑胶鉴定出现了两条带分别在750bp和2500bp处出现多余的带,见图二。
请大家帮忙看看这是怎么回事?实验卡在这,急急急啊~~~

构建重组质粒遇到了问题,请大家帮忙看看~~谢谢~~!
图1.MAN和pET-28a质粒双酶切后跑胶.jpg


构建重组质粒遇到了问题,请大家帮忙看看~~谢谢~~!-1
图2.MAN和pET-28a质粒双酶切胶回后鉴定.jpg
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aoluoquan

银虫 (正式写手)

第二个图是回收产物,直接电泳的吗?还是连接转化小抽酶切鉴定的结果,用的哪个公司的酶体系条件,酶切位点,序列,做之前有没有测序?

发自小木虫Android客户端
2楼2016-03-05 13:23:48
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屁桃粉

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by aoluoquan at 2016-03-05 13:23:48
第二个图是回收产物,直接电泳的吗?还是连接转化小抽酶切鉴定的结果,用的哪个公司的酶体系条件,酶切位点,序列,做之前有没有测序?

图二是酶切回收产物直接电泳的,takara 公司的QuickCut EcoRI和XhoI,pET28a是商用载体,pUC57-MAN是生物公司合成的
3楼2016-03-05 14:14:38
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ken19860823

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
屁桃粉: 金币+10, ★有帮助 2016-03-06 21:23:32
看酶过期了没,然后建议换普通takara的酶双酶切,别用快切酶系统。分子实验多试几次就好,这个不麻烦。
做基因修饰的老菜鸡
4楼2016-03-06 10:58:14
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屁桃粉

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by ken19860823 at 2016-03-06 10:58:14
看酶过期了没,然后建议换普通takara的酶双酶切,别用快切酶系统。分子实验多试几次就好,这个不麻烦。

我刚买的酶呢,保质期到18年,那我再试下普通酶,谢谢谢谢~~O(∩_∩)O
5楼2016-03-06 21:23:10
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fmm123

铜虫 (初入文坛)

请问你的pET28a-载体是买的吗?
6楼2016-03-07 08:54:06
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屁桃粉

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by fmm123 at 2016-03-07 08:54:06
请问你的pET28a-载体是买的吗?

是的啊

发自小木虫Android客户端
7楼2016-03-07 20:03:47
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sdjnyxn123

银虫 (小有名气)

目的基因是不是可以直接PCR扩增出条带来进行回收,这样就不用酶切了
8楼2016-03-08 09:25:12
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nannanz2012

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
屁桃粉: 金币+5, ★有帮助, 确定没有其他酶切位点,也没有其他特殊要求,我试下延长电泳时间,谢谢 2016-03-10 11:23:37
首先确定载体上有你需要的片段,酶切位点液确保存在,而且其他位置没有酶切位点。其次这两种酶酶切条件有没有特别的要求。最后实在没办法可以适当延长电泳时间
9楼2016-03-08 11:17:00
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