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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建重组质粒遇到了问题，请大家帮忙看看~~谢谢~~！
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屁桃粉

新虫 (小有名气)

[求助] 构建重组质粒遇到了问题，请大家帮忙看看~~谢谢~~！ 已有2人参与

准备构建pET28a-MAN重组质粒，MAN基因在pUC57载体上，长度1100bp。
现把pET28a和pUC57分别双酶切后跑胶，见图一，分别切下1100bp和5300bp的片段然后用天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收后，再跑胶鉴定出现了两条带分别在750bp和2500bp处出现多余的带，见图二。
请大家帮忙看看这是怎么回事？实验卡在这，急急急啊~~~

构建重组质粒遇到了问题，请大家帮忙看看~~谢谢~~！
图1.MAN和pET-28a质粒双酶切后跑胶.jpg


构建重组质粒遇到了问题，请大家帮忙看看~~谢谢~~！-1
图2.MAN和pET-28a质粒双酶切胶回后鉴定.jpg
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1楼 2016-03-05 11:57:30
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aoluoquan

银虫 (正式写手)
第二个图是回收产物，直接电泳的吗？还是连接转化小抽酶切鉴定的结果，用的哪个公司的酶体系条件，酶切位点，序列，做之前有没有测序？

发自小木虫Android客户端
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2楼2016-03-05 13:23:48
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屁桃粉

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by aoluoquan at 2016-03-05 13:23:48
第二个图是回收产物，直接电泳的吗？还是连接转化小抽酶切鉴定的结果，用的哪个公司的酶体系条件，酶切位点，序列，做之前有没有测序？

图二是酶切回收产物直接电泳的，takara 公司的QuickCut EcoRI和XhoI，pET28a是商用载体，pUC57-MAN是生物公司合成的
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3楼2016-03-05 14:14:38
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ken19860823

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
屁桃粉: 金币+10, ★有帮助 2016-03-06 21:23:32
看酶过期了没，然后建议换普通takara的酶双酶切，别用快切酶系统。分子实验多试几次就好，这个不麻烦。
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做基因修饰的老菜鸡
4楼2016-03-06 10:58:14
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屁桃粉

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ken19860823 at 2016-03-06 10:58:14
看酶过期了没，然后建议换普通takara的酶双酶切，别用快切酶系统。分子实验多试几次就好，这个不麻烦。

我刚买的酶呢，保质期到18年，那我再试下普通酶，谢谢谢谢~~O(∩_∩)O
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5楼2016-03-06 21:23:10
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fmm123

铜虫 (初入文坛)
请问你的pET28a-载体是买的吗？
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6楼2016-03-07 08:54:06
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屁桃粉

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by fmm123 at 2016-03-07 08:54:06
请问你的pET28a-载体是买的吗？

是的啊

发自小木虫Android客户端
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7楼2016-03-07 20:03:47
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sdjnyxn123

银虫 (小有名气)
目的基因是不是可以直接PCR扩增出条带来进行回收，这样就不用酶切了
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8楼2016-03-08 09:25:12
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nannanz2012

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
屁桃粉: 金币+5, ★有帮助, 确定没有其他酶切位点，也没有其他特殊要求，我试下延长电泳时间，谢谢 2016-03-10 11:23:37
首先确定载体上有你需要的片段，酶切位点液确保存在，而且其他位置没有酶切位点。其次这两种酶酶切条件有没有特别的要求。最后实在没办法可以适当延长电泳时间
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9楼2016-03-08 11:17:00
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