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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 菌液PCR有条带，质粒双酶切只有一条带，是怎么回事？急！
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上官abc

金虫 (正式写手)

王下七武海

[交流] 菌液PCR有条带，质粒双酶切只有一条带，是怎么回事？急！

RACE PCR后经过一系列步骤，到菌液PCR时有目的条带，但很浅。
然后大量摇菌并提取质粒进行双酶切，发现只有一条带，貌似这条带就是载体PMD18-T。上一次没进行双酶切就送质粒去测序，结果测序公司发回报告说送去的是空载体。这次看来也是没连上，实在不知道为何老是连不上PMD18-T，请各位大侠指点迷津，谢谢！  我用的是宝生物的RACE和PMD18-T试剂盒，菌液PCR目的片段470bp左右，3'RACE得到的目的片段在2000bp左右。
菌液PCR有条带，质粒双酶切只有一条带，是怎么回事？急！
双酶切电泳图


菌液PCR有条带，质粒双酶切只有一条带，是怎么回事？急！-1
菌液PCR电泳图
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1楼 2016-03-04 21:13:36
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yvonne9044

新虫 (正式写手)
★
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菌液pcr很浅就是假阳性，连T一般都没问题，你再试试是不是药品问题

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3楼2016-03-05 00:47:59
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上官abc

金虫 (正式写手)

王下七武海
引用回帖:
4楼: Originally posted by jackyoung at 2016-03-05 09:02:20
应该是假阳性，PCR体系或所用菌液中有污染，毕竟T载连这么大的片段那个效率是很低的。另外，3'RACE别没事就搞那么大片段，这有点儿扯了。这种体系中亲测还是500-1000比较靠谱，要不那个成功率太低。
...

我的中间片段在基因上的位置是比较靠近5'端的，距离3'端就将近1700bp多，所以在这个片段基础上设计的引物出的3'片段就只能长一些了.......
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7楼2016-03-06 21:30:52
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匿名

用户注销 (著名写手)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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2楼2016-03-04 21:28:56
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jackyoung

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
应该是假阳性，PCR体系或所用菌液中有污染，毕竟T载连这么大的片段那个效率是很低的。另外，3'RACE别没事就搞那么大片段，这有点儿扯了。这种体系中亲测还是500-1000比较靠谱，要不那个成功率太低。

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CestLaVie
4楼2016-03-05 09:02:20
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
应该很好连接，增加目的片段的量，反正多了也没坏处。
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5楼2016-03-05 09:27:36
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上官abc

金虫 (正式写手)

王下七武海
引用回帖:
3楼: Originally posted by yvonne9044 at 2016-03-05 00:47:59
菌液pcr很浅就是假阳性，连T一般都没问题，你再试试是不是药品问题

今天又看了看，RACE试剂盒里有提供的载体，我还傻乎乎的去连了PMD18-T。之所以连不上，我觉得可能是因为两种方法原理不同。
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6楼2016-03-06 21:27:32
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上官abc

金虫 (正式写手)

王下七武海
引用回帖:
5楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2016-03-05 09:27:36
应该很好连接，增加目的片段的量，反正多了也没坏处。

我现在考虑是用错了载体的原因
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8楼2016-03-06 21:31:28
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上官abc

金虫 (正式写手)

王下七武海
引用回帖:
6楼: Originally posted by 上官abc at 2016-03-06 21:27:32
今天又看了看，RACE试剂盒里有提供的载体，我还傻乎乎的去连了PMD18-T。之所以连不上，我觉得可能是因为两种方法原理不同。...

果然，RACE产物缺少A尾，得用加A试剂盒加上A尾才能连T。
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9楼2016-03-07 17:36:52
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上官abc

金虫 (正式写手)

王下七武海
引用回帖:
4楼: Originally posted by jackyoung at 2016-03-05 09:02:20
应该是假阳性，PCR体系或所用菌液中有污染，毕竟T载连这么大的片段那个效率是很低的。另外，3'RACE别没事就搞那么大片段，这有点儿扯了。这种体系中亲测还是500-1000比较靠谱，要不那个成功率太低。
...

用宝生物试剂盒得到的RACE产物缺少A尾，得用加A试剂盒加上A尾才能连T。
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10楼2016-03-07 17:37:43
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