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上官abc

金虫 (正式写手)

王下七武海

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[交流] 菌液PCR有条带，质粒双酶切只有一条带，是怎么回事？急！

RACE PCR后经过一系列步骤，到菌液PCR时有目的条带，但很浅。
然后大量摇菌并提取质粒进行双酶切，发现只有一条带，貌似这条带就是载体PMD18-T。上一次没进行双酶切就送质粒去测序，结果测序公司发回报告说送去的是空载体。这次看来也是没连上，实在不知道为何老是连不上PMD18-T，请各位大侠指点迷津，谢谢！我用的是宝生物的RACE和PMD18-T试剂盒，菌液PCR目的片段470bp左右，3'RACE得到的目的片段在2000bp左右。

双酶切电泳图

菌液PCR电泳图

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【资料】分子生物学常见问题解答已经有30人回复

1楼 2016-03-04 21:13:36

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上官abc

金虫 (正式写手)

王下七武海

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引用回帖:

4楼: Originally posted by jackyoung at 2016-03-05 09:02:20
应该是假阳性，PCR体系或所用菌液中有污染，毕竟T载连这么大的片段那个效率是很低的。另外，3'RACE别没事就搞那么大片段，这有点儿扯了。这种体系中亲测还是500-1000比较靠谱，要不那个成功率太低。
...

我的中间片段在基因上的位置是比较靠近5'端的，距离3'端就将近1700bp多，所以在这个片段基础上设计的引物出的3'片段就只能长一些了.......