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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助 关于PCR反应中各反应期效率关系
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370828435

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助 关于PCR反应中各反应期效率关系 已有1人参与

主要是需要了解 分别在指数期和平台期：多重PCR反应中 dNtp、酶、模板、引物等随着时间增加哪个对反应效率影响最大 他们相互之间呈现一个什么关系？
各位大神帮帮忙 在此谢过 如果不清楚我的问题可以回帖我细说 谢谢！
（最好推荐给我相关文献 中文外文都行）
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1楼 2016-02-03 09:21:03
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lifechuteng

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先，引物肯定是过量的，即便在PCR反应后期。
其次，dNTP也是过量的。
第三有点复杂，就是模板的量，模板分为两种，第一种是反应起始您添加的模板量，这个可控。第二种是随着反应循环积累起来的新合成的模板量，这个跟酶、引物、dNTP均有很大关系。
（这里插一点，如果其实模板量很大，也会造成反应后期引物，dNTP不够的情况）
第四就是酶，虽然现在使用的都是耐热的酶，但也不能保证所有的酶都在温度反复变化中存活下来，每个循环中，必然有一部分酶壮烈牺牲（失活）……
而且对于多重PCR，酶、dNTP都是制约因素。
如果假设扩增效率为100%，反应所需原料都足够，那么可以粗略认为产物的摩尔数跟引物的摩尔数是差不多的。
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2楼2016-02-03 09:30:12
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lifechuteng

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我粗略算了一下，不知道对不对：
模板：以pUC18质粒为例，加1ng = 0.57×10^-15 mol.
扩增产物：1000bp（这个与dNTP用量有关系）
引物：500 pmol，即 5×10^-7 mol.
dNTP：4 × 2 × 10^-4 mol=8 × 10^-4 mol .

若引物、dNTP、酶都足够，效率为100%，反应循环30次，则扩增2×10^9拷贝
也就是0.57× 10^-15 × 2×10^9 ≈ 1 × 10^-6个产物
那么需要1 × 10^-6个引物，需要dNTP  1 × 10^-6 × 2 × 1000 = 2 ×10^-3个。
对比发现：引物不够了！dNTP也捉襟见肘！

但这仅仅是理论计算，与实际有所不同的，实际模板可能比这个少，PCR酶的反应效率也不会达到100%，所以不会有这么多产物的。不知道我算的对不对……
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3楼2016-02-03 10:38:31
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370828435

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-02-03 10:38:31
我粗略算了一下，不知道对不对：
模板：以pUC18质粒为例，加1ng = 0.57×10^-15 mol.
扩增产物：1000bp（这个与dNTP用量有关系）
引物：500 pmol，即 5×10^-7 mol.
dNTP：4 × 2 × 10^-4 mol=8 × 10^-4 mol  ...

非常感谢你的回答 请问你知道在一个单位的Taq聚合酶中或者1ul酶中含有多少个分子数的酶吗？因为现在确定dNTP/模板和primer的量 但是不知道酶的分子量 所以不确定达到平台期是因为酶或者是dNTP不够引起的 或者有没有相关文献？
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4楼2016-02-03 11:24:07
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370828435

新虫 (初入文坛)
还有就是有人知道 随着PCR反应 酶的状态是怎么样的？
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5楼2016-02-03 11:48:48
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lifechuteng

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 370828435 at 2016-02-03 11:48:48
还有就是有人知道 随着PCR反应 酶的状态是怎么样的？

一般不看酶蛋白的分子个数的，一般是看酶活力的，比如在70°C，30分钟内将10 nmol的脱氧核糖核酸聚合成多核苷酸片段所需要的酶量定义为1 U~
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6楼2016-02-03 12:05:28
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370828435

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-02-03 12:05:28
一般不看酶蛋白的分子个数的，一般是看酶活力的，比如在70°C，30分钟内将10 nmol的脱氧核糖核酸聚合成多核苷酸片段所需要的酶量定义为1 U~...

嗯嗯 我知道 一般是看酶的活力单位 但是现在有个问题 我们做PCR 现在知道dNTP的量知道模板和primer的分子量 反正到达平台期 不知道是因为dNTP消耗光了还是酶量不足 所以我想知道1个酶单位中有多少的酶分子 这样是否能够推算到达平台期是否还有剩余的酶？
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7楼2016-02-03 12:56:19
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370828435

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-02-03 12:05:28
一般不看酶蛋白的分子个数的，一般是看酶活力的，比如在70°C，30分钟内将10 nmol的脱氧核糖核酸聚合成多核苷酸片段所需要的酶量定义为1 U~...

在PCR反应中 为什么随着反应时间的增加 酶的活力会降低直到最后失活？酶在pcr中照理来说是不会消耗的对吧？
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8楼2016-02-03 13:31:54
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lifechuteng

新虫 (小有名气)
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8楼: Originally posted by 370828435 at 2016-02-03 13:31:54
在PCR反应中 为什么随着反应时间的增加 酶的活力会降低直到最后失活？酶在pcr中照理来说是不会消耗的对吧？...

理论上是耐热酶，但是酶毕竟是个蛋白质，它再耐热，在多轮循环之后，总会有一部分失去活性的。但是平台期的出现是由于引物或者dNTP耗光吧，并不是因为酶都失活了。
楼主实验遇到什么具体问题了吗？
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9楼2016-02-03 13:41:39
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370828435

新虫 (初入文坛)
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9楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-02-03 13:41:39
理论上是耐热酶，但是酶毕竟是个蛋白质，它再耐热，在多轮循环之后，总会有一部分失去活性的。但是平台期的出现是由于引物或者dNTP耗光吧，并不是因为酶都失活了。
楼主实验遇到什么具体问题了吗？...

嗯嗯 真的非常感谢 我现在遇到的问题是：PCR进入平台期 但是无法确定是什么的缺失导致进入平台期 照理来说酶是不会消耗 但是每个双链的合成都需要1分子的酶作用下dNTP才能渗入双链 后期合成的双链多了 会不会酶分子不足以催化他们的合成导致进入平台期？
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10楼2016-02-03 13:45:17
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