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求助 关于PCR反应中各反应期效率关系 已有1人参与
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主要是需要了解 分别在指数期和平台期：多重PCR反应中 dNtp、酶、模板、引物等随着时间增加哪个对反应效率影响最大 他们相互之间呈现一个什么关系？ 各位大神帮帮忙 在此谢过 如果不清楚我的问题可以回帖我细说 谢谢！  （最好推荐给我相关文献 中文外文都行） |
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7楼2016-02-03 12:56:19
lifechuteng
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【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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首先，引物肯定是过量的，即便在PCR反应后期。 其次，dNTP也是过量的。 第三有点复杂，就是模板的量，模板分为两种，第一种是反应起始您添加的模板量，这个可控。第二种是随着反应循环积累起来的新合成的模板量，这个跟酶、引物、dNTP均有很大关系。 （这里插一点，如果其实模板量很大，也会造成反应后期引物，dNTP不够的情况） 第四就是酶，虽然现在使用的都是耐热的酶，但也不能保证所有的酶都在温度反复变化中存活下来，每个循环中，必然有一部分酶壮烈牺牲（失活）…… 而且对于多重PCR，酶、dNTP都是制约因素。 如果假设扩增效率为100%，反应所需原料都足够，那么可以粗略认为产物的摩尔数跟引物的摩尔数是差不多的。 |
2楼2016-02-03 09:30:12
lifechuteng
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【答案】应助回帖
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我粗略算了一下，不知道对不对： 模板：以pUC18质粒为例，加1ng = 0.57×10^-15 mol. 扩增产物：1000bp（这个与dNTP用量有关系） 引物：500 pmol，即 5×10^-7 mol. dNTP：4 × 2 × 10^-4 mol=8 × 10^-4 mol . 若引物、dNTP、酶都足够，效率为100%，反应循环30次，则扩增2×10^9拷贝 也就是0.57× 10^-15 × 2×10^9 ≈ 1 × 10^-6个产物 那么需要1 × 10^-6个引物，需要dNTP 1 × 10^-6 × 2 × 1000 = 2 ×10^-3个。 对比发现：引物不够了！dNTP也捉襟见肘！ 但这仅仅是理论计算，与实际有所不同的，实际模板可能比这个少，PCR酶的反应效率也不会达到100%，所以不会有这么多产物的。不知道我算的对不对…… |
3楼2016-02-03 10:38:31
4楼2016-02-03 11:24:07