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tgifi

新虫 (小有名气)

[求助] 求解pcr模板2.7k,P两端或中间一部分可以出来,p全长时候只能出来800bp.怎么解救 已有3人参与

如题,求大神帮忙(≧▽≦)

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tedaluobo

金虫 (小有名气)

重新设计引物,扩增比目的片段大一些,引物设计位置在promoter和终止子后,克隆成功后,再用你之前设计的引物扩,就能得到目的序列了。
楼主扩过中间片段,可以尝试目的序列分成几段,然后设计一个特殊的引物,用overlap PCR试试

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追云沐雨
2楼2016-01-15 13:08:34
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tgifi

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by tedaluobo at 2016-01-15 13:08:34
重新设计引物,扩增比目的片段大一些,引物设计位置在promoter和终止子后,克隆成功后,再用你之前设计的引物扩,就能得到目的序列了。
楼主扩过中间片段,可以尝试目的序列分成几段,然后设计一个特殊的引物,用ov ...

这个就是overpcr来的,再用它做模板就有杂带了

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3楼2016-01-15 15:51:06
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梦想天行

木虫 (职业作家)

4楼2016-01-15 15:53:03
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梦想天行

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
tgifi: 金币+5 2016-01-15 15:57:29
楼主你的问题我也正碰到,好烦心啊

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5楼2016-01-15 15:56:56
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3306549

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
检查序列,重新设计引物
2700bp延伸至少3min吧
6楼2016-01-15 18:53:26
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
换酶,或者touchdown, 10K的扩增都已经解决了,,,酶就不给其它公司广告了
行至水穷处,坐看云起时
7楼2016-01-16 17:18:40
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jackyoung

新虫 (正式写手)

两端和中间括增出来的确定对吗?已知序列还是怎么?建议如下:
1.通过各种数据库多收集信息,包括优化克隆策略(尤其是引物设计)
2.实验需要重复,比如重新制备模板,优化PCR条件(稀释后续PCR模板,增加overlap步骤的梯度设置等)

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CestLaVie
8楼2016-01-18 09:01:38
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tgifi

新虫 (小有名气)

模板是已知序列,之前扩增的没有测序,只是跑了一下胶,发现是对的

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9楼2016-01-18 23:02:11
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tgifi

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by pennchem at 2016-01-16 17:18:40
换酶,或者touchdown, 10K的扩增都已经解决了,,,酶就不给其它公司广告了

酶应该没有问题

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10楼2016-01-18 23:03:17
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