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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » RNA提取过程DNA干扰问题-用于RT-PCR
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荞麦tao

新虫 (小有名气)

[求助] RNA提取过程DNA干扰问题-用于RT-PCR 已有2人参与

各位好，我提取的植物叶片RNA，用的 the Fruit mate for RNA purification (Takara, China)。提取完也进行了检测，无DNA杂质。
但是发了文章，审稿专家说Takara公司提取的RNA必须用DNAaseI进行处理。
问题是我没有样品了。当初我也进行了DNA检测，证明了RNA的纯度。希望分子这块的专家能从专业水平帮我想想该如何进行回复审稿意见？？
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1楼 2016-01-13 18:05:48
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反应链

新虫 (正式写手)
How did you detect the DNA contaminants?

In general, it must be set up a negative control, which was omitted reverse transcriptase for DNA contaminant detection.

RNA提取过程DNA干扰问题-用于RT-PCR
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2楼2016-01-13 19:16:29
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荞麦tao

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 反应链 at 2016-01-13 19:16:29
How did you detect the DNA contaminants?

In general, it must be set up a negative control, which was omitted reverse transcriptase for DNA contaminant detection.

...

我跑的电泳，并用分光广度进行检测的。这样可以吗？
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3楼2016-01-13 20:35:46
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反应链

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 荞麦tao at 2016-01-13 20:35:46
我跑的电泳，并用分光广度进行检测的。这样可以吗？...

No. Those methods can't detect the extremely small amount of genomic DNA, which could affect the result of RT-PCR.

You must redo RNA preparation with DNaseI treated, otherwise you should submit your paper to the journal with lower IF.
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

荞麦tao
4楼2016-01-14 09:28:07
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荞麦tao

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by 反应链 at 2016-01-14 09:28:07
No. Those methods can't detect the extremely small amount of genomic DNA, which could affect the result of RT-PCR.

You must redo RNA preparation with DNaseI treated, otherwise you should submit  ...

谢谢你，想再问个问题，我知道引物序列，如何知道基因序列号？？我输入引物查出来很多基因，甚至于基因名字都是一样的，可是序列号不一样。我怎么区分开
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5楼2016-01-16 20:09:57
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紫萸香慢001

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 反应链 at 2016-01-13 19:16:29
How did you detect the DNA contaminants?

In general, it must be set up a negative control, which was omitted reverse transcriptase for DNA contaminant detection.

...

请问，我在验证DNA有无污染的时候，可不可以这样:新合成的RNA，用普通PCR的含Taq酶的Mix来进行相关基因的扩增，如果跑胶之后有阳性结果，是不是说明我提的RNA里面有DNA污染？？这么问题困扰我了好久，希望您能为我解答，谢谢~\(≧▽≦)/~

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6楼2016-01-16 21:12:06
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原来，是这样

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

不能用跑电泳的方式判断是否有无DNA残留，必须要用DNA酶消化，微量的DNA跑胶是看不到的，而且用分光光度计是检测不出来的，对你反转录之后的cDNA有几率产生干扰，所以那个审稿的的确很严谨，我们老师也是要求我们必须做DNA的消化。

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7楼2016-01-16 23:20:50
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xiaoweiwei121

荣誉版主 (文坛精英)

这潭水蓝的深邃

优秀区长优秀区长优秀版主优秀版主
这个必须用DNaseI
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8楼2016-01-17 04:26:19
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刘书杰

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引物，设计跨越至少一个内含子、根据产物大小就可以排除dna干扰。

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9楼2016-01-17 06:50:58
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