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yuman0709

铁虫 (初入文坛)

[求助] 定点突变已有3人参与

做定点突变,用的是Pfu聚合酶,引物里含突变位点,两引物GC含量分别是72.5%  65.1%,我用的退火温度是60度,第一次是P出条带了,但样品被我不小心扔了,用同样条件重新做PCR,但后来怎么P都是弥散的条带,用Primistar,也是弥散条带,一直都是弥散条带,请求大神指导
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BESTWWZ

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-02-12 22:42:16
我最近也在做定点突变,上一次尝试了温度梯度PCR,从55℃一直到62℃,在60℃以上就是弥散带,但是更低的温度是可以P出来的,所以推荐你试下温度梯度,更低的温度也许能P出来
2楼2016-02-06 10:26:38
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匿名

用户注销 (著名写手)


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-02-12 22:42:32
本帖仅楼主可见
3楼2016-02-10 02:57:25
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土豆专业户

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-02-12 22:42:54
前一阵子做了几个突变,过程还算顺利。不知道楼主采用的是哪种突变方法,我用的是方法来自这篇文献An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol希望能对你有所帮助,有不明白的地方还可以交流。
4楼2016-02-12 11:46:11
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