应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 菌检
111/2返回列表12下一页
查看: 2632  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

家喻户晓

新虫 (小有名气)

[求助] 菌检 已有1人参与

我之前用一对引物58℃扩启动子，也扩出来了，现在连T载，挑阳性克隆，为什么一直没有，是不是加有酶切位点的引物的退火温度应该提高一点啊！

发自小木虫Android客户端
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2015-12-30 19:19:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

科学小覃

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
T载体连接出现假阳性是常有的事，PCR只要有条带大小正确基本没问题，主要是纯化回收过程中，DNA一定要纯，连接时片段至少是载体的3倍以上。
赞一下 回复此楼
生物科学
2楼2015-12-30 20:11:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

反应链

新虫 (正式写手)
Can you show me your agarose gel eletrophoresis of PCR products? Which polymerase did you use? Was there one A added at 3'-termini?
赞一下 回复此楼
3楼2015-12-30 20:34:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ayumi7667

新虫 (初入文坛)
???????taq????????м?a?????????????{??Y????????? insert??3 ?|?w??1??λ??mole

????С???Android?????
赞一下 回复此楼
4楼2015-12-30 20:54:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

家喻户晓

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 反应链 at 2015-12-30 20:34:46
Can you show me your agarose gel eletrophoresis of PCR products? Which polymerase did you use? Was there one A added at 3'-termini?

I used GXL ploymerase .One A was added at 3‘-termini usingTaq
ploymerase.
菌检
20151213-OsMTP11启动子.jpg
赞一下 回复此楼
5楼2015-12-30 21:30:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

家喻户晓

新虫 (小有名气)
???????:
4?: Originally posted by ayumi7667 at 2015-12-30 20:54:29
???????taq????????м?a?????????????{??Y????????? insert??3 ?|?w??1??λ??mole

??????Taq??A?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????У?????????????м?????
赞一下 回复此楼
6楼2015-12-30 21:32:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

家喻户晓

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 科学小覃 at 2015-12-30 20:11:08
T载体连接出现假阳性是常有的事，PCR只要有条带大小正确基本没问题，主要是纯化回收过程中，DNA一定要纯，连接时片段至少是载体的3倍以上。

纯化回收后测定的浓度时33.664ng/μL，连接时片段与T载比为7：1—9：1，但是挑斑菌检时都扩不出来
赞一下 回复此楼
7楼2015-12-30 21:35:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ayumi7667

新虫 (初入文坛)
???f?????u?????????e???x????????{??Y??????|?????????????????x???????colony PCR ?????????LB plate?? PCR????insert????L?????????? ??_??????????????????|?w

????С???Android?????
赞一下 回复此楼
8楼2015-12-30 22:02:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ayumi7667

新虫 (初入文坛)
???????:
8?: Originally posted by ayumi7667 at 2015-12-30 22:02:01
???f?????u?????????e???x????????{??Y??????|?????????????????x???????colony PCR ?????????LB plate?? PCR????insert????L?????????? ??_??????????????????|?w
...

??? ????????????????? ?`?????????

????С???Android?????
赞一下 回复此楼
9楼2015-12-30 22:03:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

反应链

新虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 家喻户晓 at 2015-12-30 21:32:37
我是用Taq加A，没有用蓝白斑挑克隆，但是我随意挑选几个斑摇菌提质粒并测序的话，结果也是连上的，但是菌检就是没有，而且测序结果都有碱基突变...

Was it your first time of screening for recombinants? You did get the resulting recombinants afer TA-cloning, though the colony PCR was false negative. Therefore, something wrong might happen while you made colony preparation for colony PCR.

A well isolated colony was picked and transferred to 50ul of sterile water, boiled for 10 minutes, centrifuged at 12000rpm for 5minutes, and 2ul of the supernatant was used in each amplification (20ul volumes in total).
赞一下 回复此楼

» 本帖附件资源列表

  • 欢迎监督和反馈：小木虫仅提供交流平台，不对该内容负责。
    本内容由用户自主发布，如果其内容涉及到知识产权问题，其责任在于用户本人，如对版权有异议，请联系邮箱：xiaomuchong@tal.com
  • 附件 1 : screening_recombinants_row.pdf
    • 2015-12-30 22:55:47, 415.77 K
10楼2015-12-30 22:56:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 家喻户晓 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[公派出国] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 qTvzQBRAHjCi 2026-08-07 4/200 2026-08-08 17:27 by oEVWOejN9taj
[基金申请] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 qTvzQBRAHjCi 2026-08-07 4/200 2026-08-08 17:22 by oEVWOejN9taj
[论文投稿] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 qTvzQBRAHjCi 2026-08-07 4/200 2026-08-08 16:47 by oEVWOejN9taj
[基金申请] 这样的filecode谁见过 +5 布布和一二 2026-08-08 8/400 2026-08-08 14:54 by archvillain
[公派出国] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 HEQlVqMTIA7d 2026-08-07 6/300 2026-08-08 14:39 by oEVWOejN9taj
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 HEQlVqMTIA7d 2026-08-07 5/250 2026-08-08 14:27 by oEVWOejN9taj
[基金申请] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 HEQlVqMTIA7d 2026-08-07 4/200 2026-08-08 14:27 by oEVWOejN9taj
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 KXLV3nuBVBY7 2026-08-07 5/250 2026-08-08 14:07 by oEVWOejN9taj
[论文投稿] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 KXLV3nuBVBY7 2026-08-07 6/300 2026-08-08 14:01 by oEVWOejN9taj
[基金申请] 基金中了 +14 laoda193707 2026-08-06 14/700 2026-08-08 00:23 by 实验小白ha
[基金申请] 固定端突然变了，今天 +6 archvillain 2026-08-06 10/500 2026-08-07 16:03 by 医学老男孩
[基金申请] filecode与中标关系的预测 +3 布布和一二 2026-08-07 3/150 2026-08-07 15:09 by gltch
[基金申请] filecode变化情况 +6 布布和一二 2026-08-07 22/1100 2026-08-07 14:45 by 且听虎啸
[基金申请] 大家散了吧，后缀研究没有意义，别浪费时间了，过好目前的每一天，不要焦虑 +5 Tide man 2026-08-06 7/350 2026-08-07 13:11 by 医学老男孩
[基金申请] filecode +14 等待解的谜 2026-08-06 19/950 2026-08-07 12:20 by wlwhappy
[基金申请] 好消息？这个有何含义？？？ +8 Tide man 2026-08-05 10/500 2026-08-05 16:14 by xmuxiaoyu
[考博] 【2027博士申请】纳米药物递送方向 20+3 13586093586 2026-08-03 4/200 2026-08-05 09:59 by lfy8008
[基金申请] 有没有H口的？有收到消息的吗？ +3 超级海虾 2026-08-04 3/150 2026-08-04 17:26 by 学教育滴
[基金申请] 纯娱乐，不喜欢勿喷 +7 Tide man 2026-08-04 10/500 2026-08-04 15:10 by loufangrui
[基金申请] 面上提前没消息，有中的吗 +14 archvillain 2026-08-02 18/900 2026-08-04 14:42 by archvillain
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭