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椪柑某基因全长扩增遇到困难，请大家指点指点，谢谢！
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现在在做椪柑HSF基因的克隆实验，已有柑橘（椪柑属于柑橘属）全基因组序列，需要扩增的基因序列是在甜橙基因库里搜索得到的（http://citrus.hzau.edu.cn/orange/index.php）。甜橙基因库中找到目标基因CDS区域，用primerp5头尾数出长度为17-24bp的碱基作为引物（下游为互补），但都无法扩增出条带（17-27bp的都试过了），已经做将近一个月了，很想在过年前做完，很是苦恼。 酶用的是TAKARA的LA-taq酶； cDNA使用前用actenin检测，感觉也没啥大问题； 同属不同品种的植物基因序列会不会出现差异导致无法扩增？； 引物设计基本原则也知道，但是需要克隆CDS区域全序列，只能在头尾设计的引物，所以在primer5上的评分并不高，但若椪柑中存在该基因PCR扩增引物应该也不会有多大问题呀！？； 大家以前有做过类似实验吗，请说出你们的想法和建议，谢谢！！ |
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