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真菌菌丝提取及电泳图求解释！ 已有1人参与
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用CTAB提取法提取真菌DNA,但是抽提DNA过程中只用了氯仿/异戊醇（24:1），没有使用Tris饱和酚抽提。在1%琼脂糖凝胶电泳中检测有无条带，如下图所示，请教各位大神：这是什么原因？ 急需，感激不尽。。。。。。  20151216DNA(SHEN).jpg |
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2楼2015-12-17 15:51:36
3楼2015-12-17 21:24:18
4楼2015-12-19 10:31:19
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1、用灭菌刀片（一般用酒精蘸取后在酒精灯上灼烧），刮取菌丝置于研钵中，加入适量石英砂和液氮迅速研磨2-3次确保磨成细粉（注意带厚手套防冻及确保研磨过程中一直有液氮保护，最后一次研磨完倒入液氮保护，等待转移到离心管中） 2、将研钵中的细粉迅速转移到1.5ML的离心管中，加入65℃预热的800ul 2%CTAB提取缓冲液和80ul10%SDS（也可以不用SDS），快速混匀，65℃水浴30-60Min，5-10min轻柔振荡一次。 3、12000rpm常温离心5min（一般也用10min），缓慢吸取上清液于一个新的离心管中（注意：有些离心完上层有Pr固体，吸取时注意不要吸到Pr等固体层），加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）混合液抽提2次（有些也用氯仿和异戊醇或只用氯仿），10000-12000rpm离心10min 4、缓慢吸取上清液于一个新的离心管中，缓慢加入2.5体积的异丙醇（去除多糖）无水乙醇，再加入0.1体积的3mol/L的NaAC（注意顺序）-20℃沉淀过夜 5、10000-12000rpm离心10min，丢弃上清液（倒置使管壁液体流干净） 6、加入70%乙醇漂洗2次 7、斜拿离心管，用移液枪从沉淀的对面紧贴管壁处轻轻吸出乙醇，在室温中敞盖干燥 8、所得沉淀溶于50ulTE缓冲液（或者ddH2O，双蒸水是其中的一种）中，最后置于-20℃保存 |
5楼2015-12-19 10:33:01
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The 4th step would be the problem. The order is different from my CTAB protocol, which is "Add 0.5 volume 5M NaCl and mix properly. Then add 2/3 volume ice-cold isopropanol and leave at least 20minutes (up to overnight) at -20 degrees Celsiu." It must be pointed out that once DNA and polysaccharides co-precipitate together, it becomes much more difficult to separate them than prior to precipitation. By adding 0.5 volum 5M NaCl to the CI-extracted aqueous solution just prior to precipitation by isopropanol, it is effectivly separate the DNA from polysaccarides. In my opinion, this step is the key to CTAB protocol. |
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本内容由用户自主发布，如果其内容涉及到知识产权问题，其责任在于用户本人，如对版权有异议，请联系邮箱：xiaomuchong@tal.com - 附件 1 : 3%_CTAB_DNA_Extraction_Protocol.pdf
2016-01-08 16:09:12, 50.16 K
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alice keer6楼2016-01-08 16:09:13
7楼2017-04-01 10:10:23
8楼2017-07-30 21:00:27