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alice keer

新虫 (初入文坛)

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专业: 植物病理学

[求助] 真菌菌丝提取及电泳图求解释！已有1人参与

用CTAB提取法提取真菌DNA,但是抽提DNA过程中只用了氯仿/异戊醇（24:1），没有使用Tris饱和酚抽提。在1%琼脂糖凝胶电泳中检测有无条带，如下图所示，请教各位大神：这是什么原因？
急需，感激不尽。。。。。。

20151216DNA(SHEN).jpg

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1楼 2015-12-16 20:17:24

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alice keer

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引用回帖:

3楼: Originally posted by angelyou at 2015-12-17 21:24:18
建议你把你做的全部步骤写上来，理论上我们CTAB提都是百发百中，没有提不出来的~~~而且没有酚应该也不至于啥都没有，另外跑基因组DNA你要用HINDiii的maker或者其他大于10k的maker，我猜，你第二泳道上面那个弱弱的有 ...

1、用灭菌刀片（一般用酒精蘸取后在酒精灯上灼烧），刮取菌丝置于研钵中，加入适量石英砂和液氮迅速研磨2-3次确保磨成细粉（注意带厚手套防冻及确保研磨过程中一直有液氮保护，最后一次研磨完倒入液氮保护，等待转移到离心管中）
2、将研钵中的细粉迅速转移到1.5ML的离心管中，加入65℃预热的800ul 2%CTAB提取缓冲液和80ul10%SDS（也可以不用SDS），快速混匀，65℃水浴30-60Min，5-10min轻柔振荡一次。
3、12000rpm常温离心5min（一般也用10min），缓慢吸取上清液于一个新的离心管中（注意：有些离心完上层有Pr固体，吸取时注意不要吸到Pr等固体层），加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）混合液抽提2次（有些也用氯仿和异戊醇或只用氯仿），10000-12000rpm离心10min
4、缓慢吸取上清液于一个新的离心管中，缓慢加入2.5体积的异丙醇（去除多糖）无水乙醇，再加入0.1体积的3mol/L的NaAC（注意顺序）-20℃沉淀过夜
5、10000-12000rpm离心10min，丢弃上清液（倒置使管壁液体流干净）
6、加入70%乙醇漂洗2次
7、斜拿离心管，用移液枪从沉淀的对面紧贴管壁处轻轻吸出乙醇，在室温中敞盖干燥
8、所得沉淀溶于50ulTE缓冲液（或者ddH2O，双蒸水是其中的一种）中，最后置于-20℃保存