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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 分类/鉴定 » 放线菌被细菌污染该怎么处理。
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lance-tan

金虫 (小有名气)

[求助] 放线菌被细菌污染该怎么处理。 已有3人参与

从土壤中分离的放线菌，想要进行16s 序列测定，经过扩增测序，BLAST比对发现是沙雷氏菌。于是怀疑是细菌污染，着手验证，然后，挑取斜面种进行划线于高氏培养基上培养3天后，发现并无细菌污染，重新施用SDS法提取DNA，经过测序发现比对仍然是沙雷氏菌，提取DNA的实验药品(能灭菌的），PCR管，以及EP管，水，MIX都是灭菌确认无误的。扩增引物 选用的是 8-27F，1523R。求大神们棒棒忙 我该怎么做。
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新手入门求各位大神指导
1楼 2015-12-05 22:40:35
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后方大漏勺

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens ) 又称灵杆菌，一种产生鲜红色素的细菌，存在于空气和水中，可生长在动、植物性食品中。为细菌中最小者，约0.5×(0.5～1.0)微米。近球形短杆菌，但形态多样。 粘质沙雷氏菌广泛分布于自然界，是水和土壤中的常居菌群

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2015-12-06 03:03:35
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lance-tan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 后方大漏勺 at 2015-12-06 03:03:35
粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens ) 又称灵杆菌，一种产生鲜红色素的细菌，存在于空气和水中，可生长在动、植物性食品中。为细菌中最小者，约0.5×(0.5～1.0)微米。近球形短杆菌，但形态多样。 粘质沙雷氏菌广泛分 ...

这个百度我都查过的，能帮我看看我的问题吗？谢谢
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3楼2015-12-06 14:40:43
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后方大漏勺

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我觉得这个菌太小了，混在你的菌落里

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2015-12-07 01:02:00
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371522029

金虫 (正式写手)

小鱼儿

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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lance-tan: 金币+10, ★★★很有帮助 2015-12-07 10:22:45
首先你是原位不能培养打算测菌群结构呢？还是其他情况。
对于原味测序的话，出现这种状况，我建议你从两方面考虑看看；第一，看看能否换一种适合放线菌的通用引物，杜绝使用能够扩增细菌的引物；另外一方面就是DNA提取的方法，看看破壁的时候调整一下，尽量的多破放线菌，少破细菌，扩大放线菌的DNA比例。为了保险起见，我建议你引物扩增的产物不要太大，不要大于1000bp；最好250-350之间，扩增成功率大。
如果是可培养的，当然是平板分离咯。
另外，你还可以尝试导入大肠杆菌构建重组质粒，进行测序。
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5楼2015-12-07 01:09:52
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lance-tan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 371522029 at 2015-12-07 01:09:52
首先你是原位不能培养打算测菌群结构呢？还是其他情况。
对于原味测序的话，出现这种状况，我建议你从两方面考虑看看；第一，看看能否换一种适合放线菌的通用引物，杜绝使用能够扩增细菌的引物；另外一方面就是DNA ...

是这样的，我想做的是对可培养放线菌探究，目的是利用这个地区特有优势，分离出有特殊功能的放线菌，所以原位培养法不太合适；第二，通用引物是参考了文献中的引物，是没有问题的；至于DNA提取方法，怎么多破放线菌的壁？麻烦能不能告知下。
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6楼2015-12-07 10:27:43
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yguang

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lance-tan: 金币+10, ★★★很有帮助 2015-12-07 12:05:56
1. 提取DNA所用材料均灭菌并不能解决DNA污染的问题，菌死了DNA也还在，所以假如真的实验材料污染了灭菌室不解决问题的，当然实际实验中发生因材料染菌造成DNA污染的情况极少见，但理论上还是有可能性的；
2. 建议延长培养时间，放线菌最好还是培养7天吧；
3. 换引物，用特异性高的引物
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7楼2015-12-07 11:16:50
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371522029

金虫 (正式写手)

小鱼儿
引用回帖:
6楼: Originally posted by lance-tan at 2015-12-07 10:27:43
是这样的，我想做的是对可培养放线菌探究，目的是利用这个地区特有优势，分离出有特殊功能的放线菌，所以原位培养法不太合适；第二，通用引物是参考了文献中的引物，是没有问题的；至于DNA提取方法，怎么多破放线菌 ...

放线菌是属于一类具有分支状菌丝体的细菌，革兰染色为阳性。主要依据为：①同属原核微生物：细胞核无核膜、核仁和真正的染色体；细胞质中缺乏线粒体、内质网等细胞器；核糖体为70S；②细胞结构和化学组成相似：细胞具细胞壁，主要成分为肽聚糖，并含有DPA；放线菌菌丝直径与细菌直径基本相同；③最适生长PH范围与细菌基本相同，一般呈微碱性；④都对溶菌酶和抗生素敏感，对抗真菌药物不敏感；⑤繁殖方式为无性繁殖，遗传特性与细菌相似。
這個说明重溶菌酶法试试。将样品涂布培养一下看看，放线菌菌落和细菌相差很大的。看看能否分离得到想要得菌。

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8楼2015-12-07 14:35:12
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lance-tan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 371522029 at 2015-12-07 14:35:12
放线菌是属于一类具有分支状菌丝体的细菌，革兰染色为阳性。主要依据为：①同属原核微生物：细胞核无核膜、核仁和真正的染色体；细胞质中缺乏线粒体、内质网等细胞器；核糖体为70S；②细胞结构和化学组成相似：细胞 ...

是的我已经平板验证过，只能看到很明显的放线菌菌落，并无细菌生长。
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新手入门求各位大神指导
9楼2015-12-07 15:06:44
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shiling90

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by lance-tan at 2015-12-07 15:06:44
是的我已经平板验证过，只能看到很明显的放线菌菌落，并无细菌生长。...

您好,您的问题最后怎么解决的啊，我最近也在用16S扩增放线菌，但测序结果全部显示为山岗单包菌
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10楼2016-07-25 16:11:07
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