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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 表达蛋白质粒的选择
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dahaideyu

银虫 (初入文坛)

[求助] 表达蛋白质粒的选择 已有4人参与

请帮忙系统的介绍一下质粒，关键是表达蛋白时，选择质粒需要考虑哪些因素？我想表达一个蛋白，后续可能会对其单独的结构域也进行研究，那我现在在选择质粒表达整个蛋白的时候有需要为后续研究考虑什么吗？谢谢大家啦！
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1楼 2015-12-02 16:04:16
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siriusxuan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
要研究结构可能要后期进行纯化和原核表达什么的，估计要选择PET系列的原核表达载体，带上HIS标签。
如果需要研究在真核细胞中的功能，还要构建真核表达载体，可以选择带荧光的PEGFP系列，也可以简单的PCDNA-cMYC的。
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此座可言轻社稷，江山万里起风尘。
2楼2015-12-02 18:17:18
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力攻

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
表达蛋白的质粒，看你后面的用途，你可以尝试原核的表达载体,例如p系列的，可能会实现你要的。祝好
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3楼2015-12-02 19:42:40
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kwkw

木虫 (著名写手)
在N端或C端加his-tag有利于纯化，但又可以纯化后切去，不影响体外反应和结晶

发自小木虫Android客户端
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再苦：也别忘记坚持！再烦：也别忘记微笑！再急：也要注意语气！再累：也要爱自己！低调做人，你会一次比一次稳健。高调做事，你会一次比一次优秀！
4楼2015-12-02 19:52:22
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总有二狗咬朕

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般一个合格质粒的必须要素  ：1.复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。    2.抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段  3. P/E 启动子/增强子   4.Terms 终止信号   5. 加poly（A）信号 可以起到稳定mRNA作用。
对于原核蛋白表达，一般①选择合适的启动子及相应的受体菌；  ②用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位； ③表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
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我好累，承受这个年纪不该有的帅！
5楼2015-12-03 15:18:56
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zcliang2014

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
应该先确定你的表达蛋白的目的，然后再来选择优势的表达质粒。一般分为原核表达和真核表达质粒，前者主要用于体外纯化蛋白，如带His-tag的PET系列，带GST-Tag的PGEX系列，选用不同的表达载体，就得建立相应的纯化系统，包括缓冲液的配置、珠子/柱子的选择等等，还得考虑目的蛋白的可溶性，一般大tag的融合蛋白可溶性要好一些，如GST的。这种原核纯化的蛋白一般用来制备单一的、需要量大的蛋白。真核表达载体一般是细胞、体内表达等需要时所用，较多的是PCND，也有好多公司自己开发的都可以。这个比较简单，不用建立相应的表达体系，只需要将它放到细胞或体内细胞即可，唯一考虑的是它的启动子的选择，常用质粒都是cmv的，表达效率较高。也有多种启动子经过改造的表达载体，一般用来表达需要调控表达时间及表达量的蛋白。根据你的要求，我想你以后这两种表达载体都会用到的。
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6楼2015-12-03 16:21:44
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