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蛋白质的性质 科学实验的成功总要依赖99%的汗水，汗水也能谱写一首欢乐的歌。 若你有足够的想象力，活跃的创新思维，知识可以行空组合，足下生辉，乐趣横生。 ———— 给我们的实验一点想象力的乐趣 蛋白纯化实验即将开始，其基本性质待你浏览，然而，我们更加需要的是你的热情、勇敢的想象力、探索未知的乐趣，无论是穿越英国小说笔下头脑冷静、观察力敏锐的福尔摩斯，还是炫酷机灵的名侦探柯南，他们捕获线索，处处留心观察，而蛋白纯化实验中，期待你也能以蛋白质的性质为线索，开启蛋白纯化的“侦探”情节。这里现场中的线索便是蛋白质特有的理化性质，只有初步熟识蛋白质固有的性质，灵活应用，才能根据已有的性质选择合适的纯化方法，怎么才能找到适合自己实验独特的方法，只需带着你的科学思维，一起先来了解蛋白质的理化性质。 氨基酸组成蛋白质的肽链，并且肽链两端游离着两个关键的集团：α-氨基和α-羧基，可以与酸或碱相互作用，因此蛋白质是两性电解质。蛋白质在酸性环境中与酸中和，游离成带正电荷的离子，在碱性环境中与碱中和，游离成带负电荷的离子。 另外，当蛋白处在某一特定的pH值溶液中时，蛋白分子所带的正电荷数与负电荷数相等，即净电荷数为零，蛋白质分子在电场中不移动，这时溶液的pH 称为该蛋白质的等电点（pI）。在等电点时，蛋白质溶解度最小，导电性、粘度和渗透压等也最低，蛋白质能从溶液中沉淀分离。 因此利用蛋白质的带电情况，可以利用等电点沉淀蛋白法，离子交换层析法， SDS-PAGE电泳，等点聚焦电泳方法； 蛋白质是高分子化合物，粒子大小在1-100 nm之间，属于胶体分散系范围，在蛋白质分子表面有-NH2、-COOH、=C=O、=N-H 等亲水基团，与水结合成氢键，形成一层水化膜；另外，蛋白所处溶液的pH值和蛋白自身的等电点不相同，蛋白质带同性电荷，相互排斥，所以蛋白质溶液具有胶体性质。 蛋白质的胶体性质使其在溶液中的扩散速度和渗透压较小，不能透过半透膜，因此可以通过透析的方法分离蛋白；另外通过对蛋白质胶体溶液去除水化膜，中和粒子表面所带的电荷，使蛋白发生沉淀而分离蛋白。 常见的方法有硫酸铵盐析沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀法。 亲和层析利用固相介质中的配基与混合生物分子之间亲和能力不同来进行分离，当蛋白混合液通过层析柱时，与配基能够特异性结合的蛋白质就会被吸附固定在层析柱中，这种结合在一定条件下是可逆的，选用适当的洗脱液，改变缓冲液的离子强度和pH值或者更强的配体结合溶液将结合的蛋白质洗脱下来，而无亲和力的蛋白质最先流出层析住。它通常只需要一步操作便能将目的蛋白从混合物中分离出来，并且纯度很高。常见的方法有免疫亲和纯化（抗原与抗体）、酶与底物或者抑制剂间的结合、受体与激素间的结合等。 另外，将标签（比如His、GST标签）与重组蛋白或者多肽链融合，就可以充分利用标签的性质，通过螯合金属离子固定在层析柱上，从而达到分离目的蛋白的作用。常见的有GST（谷胱甘肽S转移酶）标签融合蛋白纯化、His（组氨酸）标签融合蛋白纯化等。 利用蛋白质分子大小和形状的不同达到分离和纯化的目的，常见的方法有透析，凝胶过滤法。蛋白质大分子物质不能透过半透膜，而无机盐、水、单糖等小分子物质能够透过半透膜，因此利用透析法可以去除蛋白溶液中的金属离子；另外，利用蛋白质分子间相对分子质量的差异，当分子大小和形状不同的蛋白质混合物通过凝胶柱时，小分子物质能够通过凝胶孔，进入其内部，最后被洗脱下来，大分子被隔离在凝胶外面，随着溶剂在凝胶珠之间的空隙流出凝胶柱。 一般情况下，细胞内表达的有生物学活性的可溶性蛋白，肽链间形成二硫键，折叠，形成具有功能性的蛋白，分泌到细胞周质或者培养液中。 但是，如果外源基因表达的重组蛋白在原核细胞内表达时，在细胞内部形成由膜包裹着的不溶性蛋白颗粒，聚集的蛋白颗粒往往以包涵体的形式堆积在一起。 包涵体蛋白是非折叠状或者错误折叠的不溶性蛋白聚合物，缺乏生物学活性，真核蛋白在细菌宿主中表达时往往会形成包涵体。因此如果要得到具有生物学活性的蛋白， 必须进行下一步包涵体的溶解和复性，或者考虑重新构建质粒，选择其他的表达宿主。 首先，可以通过优化细胞培养条件提高包涵体的溶解性，采取的措施有： 降低生长温度至20-30℃； 增加通风； 降低细胞培养密度，或者在细胞密度较高时，缩短诱导时间； 添加变性剂、去污剂、有机溶剂、N-十二烷基肌氨酸、还原剂； 变性剂如4-8M的尿素，4-6M的盐酸胍；变性剂在溶解包涵体蛋白时，必须事先检测他们和目的蛋白的兼容性，可以利用层析柱法分离溶解蛋白和变性剂，在分离的同时进行纯化和复性。 去污剂如SDS，CTAB，Tween-20等，溶解能力比变性剂更加温和。 还原剂如β-巯基乙醇，二硫苏糖醇，谷胱甘肽等，对于含有半胱氨酸的重组蛋白，还原剂的使用非常重要。 其次，溶解蛋白的复性； 溶解后的重组蛋白必须正确的折叠才能形成具有功能性的蛋白，影响复性的因素主要有pH值、去除变性剂的速度，还原剂的存在，宿主蛋白与重组蛋白之间的浓度比。 复性的技术有：逐步透析、柱上复性、稀释到接近中性pH，凝胶过滤层析。 蛋白复性之后可根据其他纯化蛋白的方法进一步纯化蛋白。 后记： 每一种蛋白质都有其相应的氨基酸的序列，表现出不同的理化性质，这些物理上的差异性可以作为进行蛋白纯化的线索，具体的实验操作还需多次实践验证，愿这些基础知识能为你的实验操作提供理论支持，实验中若有疑惑，可以给我发邮件（xiaoli_li@sinobiological.cn），我们公司北京义翘神州生物有专业的蛋白表达纯化团队，多方打听，总能找到一点对您实验有利的线索，若有需要请联系我。 |
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