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xincer

木虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量PCR 本底过高 已有2人参与

麻烦帮我看一下 ,我是自己设计的双链探针分别标记的猝灭(BHQ1)和荧光基团(FAM),退火时检测,有靶序列时双链解链然后发光,为什么本底信号这么高,我试过降低退火温度,结果本底还是有60000左右,用的是sepone plus 的仪器,会不会是操作过程中荧光的污染啊,可是我每次跑都会有这么多本底。大家给看看,  还有如果本底信号过高是不是会影响系统的敏感性啊。急求帮助,谢谢了。

荧光定量PCR 本底过高
Multicomponent Plot.jpg
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xincer

木虫 (小有名气)

怎么木有人,。求帮助。啊。。。
2楼2015-12-02 09:46:05
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特务兔

新虫 (初入文坛)

因为觉得看不懂,不专业,所以不敢妄下评论

发自小木虫IOS客户端
3楼2015-12-02 10:48:37
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love_st

金虫 (著名写手)


【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
荧光信号的绝对增长量不够,所以显得本底过高,原因较多!
4楼2015-12-02 10:50:45
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xincer

木虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by love_st at 2015-12-02 10:50:45
荧光信号的绝对增长量不够,所以显得本底过高,原因较多!

增加原料或探针浓度可行吗?

发自小木虫Android客户端
5楼2015-12-02 11:21:03
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love_st

金虫 (著名写手)


引用回帖:
5楼: Originally posted by xincer at 2015-12-02 11:21:03
增加原料或探针浓度可行吗?
...

现在用的探针浓度多少
6楼2015-12-02 12:00:33
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xincer

木虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by love_st at 2015-12-02 12:00:33
现在用的探针浓度多少...

400nm  但每个循环之后探针不参与下一个循环。就和taqman类似每个循环之后荧光被积累。

发自小木虫Android客户端
7楼2015-12-02 15:51:47
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love_st

金虫 (著名写手)


引用回帖:
7楼: Originally posted by xincer at 2015-12-02 15:51:47
400nm  但每个循环之后探针不参与下一个循环。就和taqman类似每个循环之后荧光被积累。
...

浓度挺高了,探针基本也就这样了
8楼2015-12-02 16:03:56
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xincer

木虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by love_st at 2015-12-02 16:03:56
浓度挺高了,探针基本也就这样了...

怀疑是不是探针本身的问题,有多余的荧光,或者猝灭效果不好。

发自小木虫Android客户端
9楼2015-12-02 16:11:04
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love_st

金虫 (著名写手)


引用回帖:
9楼: Originally posted by xincer at 2015-12-02 16:11:04
怀疑是不是探针本身的问题,有多余的荧光,或者猝灭效果不好。
...

有些区域或者有些探针本身信号就很低,如果排除你体系的问题,为了提高探针信号,你可考虑重新设计探针
10楼2015-12-02 16:12:34
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