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荧光定量PCR数据处理问题 已有4人参与
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我用了两种可以抑制稻瘟病菌的放线菌处理水稻，然后接种稻瘟病菌，紧接着每天剪叶子，提RNA做反转录，然后以防御酶基因为目的基因跑荧光定量PCR。现在结果出来了，不知道怎么处理数据。实验一共分为六组。一：单独A菌处理水稻；二：单独B菌处理水稻；三：无菌水处理水稻；四：A菌处理水稻后接种稻瘟；五：B菌处理水稻后接种稻瘟；六：无菌水处理水稻后接种稻瘟；最终想说明A菌，B菌促进了防御基因表达，并且想有一个时间为横坐标，基因相对表达量为纵坐标的图。 我知道应该用2的负△△Ct的方法来算。但是问题就在于 第一个问题：我的仪器上给出的Cq值，和Ct值是一回事？ 第二个问题：△Ct=Ct目的基因—Ct内参基因，这个我知道。但是△△Ct=实验组△Ct—对照组△Ct，上述6组，我应该选哪一组作为对照组？ 第三个问题：如果是比较每一天的表达量的差异，我是以每一天的对照组来计算目的基因的表达量，还是应该以0天时的对照组来比较后续每一天的各个组的表达量？ 这么说要不要我直接给数据，哪位大神帮忙算算？ 第0天：一组目的基因Ct28.98，内参26.92，二组目的基因26.85，内参26.48；三组目的基因26.06，内参25.98；四组目的基因28.11，内参26.54；五组目的基因30.35，内参26.14，六组目的基因28.11，内参26.72 第1天：一组目的基因Ct20.64，内参22.71，二组目的基因22.14，内参22.53；三组目的基因20.44，内参22.64；四组目的基因24.55，内参23.48；五组目的基因25.6，内参23.33，六组目的基因24.80，内参23.62 万分感激，急盼各位大神伸出援手 |
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【答案】应助回帖
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第一个问题，cp=ct。 第二问题，这里你的设计里面没讲清楚问题。如果是A、B菌单纯促进水稻防御基因的话，你的第一、第二组分别对照第三就要以每天CK实验组当对照，放置所有样品随时间环境会引起细微变化。 我这里提两个问题。1、你的目的基因是否在预实验验证了它的稳定性？2、2的负△△Ct，要求基因的扩增效率达到近100%，相差不能超过5%。实际试验中，内参基因和目的基因的扩增效率都达不到，所以要换一种计算方法的。通常目标和内参基因的扩增效率不相近，可以优化或重新设计实验，或者可以Pfaffl 法（这个网站自己找，有些仪器可以自己把扩增效率放进去，可以自己计算）。另外，如果目标基因和参照基因有同样的扩增效率，但是扩增效率不等于2，那么，2–ΔΔCT 法的公式可以修正为用实际扩增效率值代替等式中的2。例如，如果目标基因和参照基因的扩增效率都为1.95，计算公式为1.95–ΔΔCT。 |
4楼2015-11-28 12:28:29
momo12345678
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