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632362481

铜虫 (小有名气)

[求助] 毕赤酵母表达 已有1人参与

想请教一下,最近在做毕赤酵母GS115表达,转化完,涂的YPDS平板,提取酵母基因组进行PCR验证,挑了10个菌落,发现都是空载体,没有转进去。怎么办?
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czfscf

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
有可能是质粒出错 密码子木有做好  也有可能没有转进去 那就重新转。

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Ecological Genomics;the scientific walking hormone
3楼2015-11-20 18:37:09
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普通回帖

MarchZR

银虫 (小有名气)

毕赤酵母表达也属于真核细胞表达吧,没转进去,重新转啊,肯定是实验操作问题,,在试一遍
2楼2015-11-20 17:02:28
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632362481

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by MarchZR at 2015-11-20 17:02:28
毕赤酵母表达也属于真核细胞表达吧,没转进去,重新转啊,肯定是实验操作问题,,在试一遍

都是电转,应该不会出啥错误吧?是不是我挑的比较少啊?还是转化效率比较低呢
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4楼2015-11-20 19:40:43
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632362481

铜虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by czfscf at 2015-11-20 18:37:09
有可能是质粒出错 密码子木有做好  也有可能没有转进去 那就重新转。

质粒都是测序过的,应该没啥问题吧,是不是转化效率低啊?我挑了十个了,是不是挑的少啊,我提基因组用OMEGAyeast kit提的,通用引物P的,你有没有做过?我这个是伯莱霉素筛选的,ppiczaB载体。
。。。
5楼2015-11-20 19:44:49
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MarchZR

银虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 632362481 at 2015-11-20 19:40:43
都是电转,应该不会出啥错误吧?是不是我挑的比较少啊?还是转化效率比较低呢...

细胞瞬时转染表达吧?可以用脂质体转染试试,通常转细胞的话,应该是比较容易转进去的吧,转化效率低也不会一个都没转进去吧,要不你先试试其他方法转染看看
6楼2015-11-23 16:48:01
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632362481

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by MarchZR at 2015-11-23 16:48:01
是细胞瞬时转染表达吧?可以用脂质体转染试试,通常转细胞的话,应该是比较容易转进去的吧,转化效率低也不会一个都没转进去吧,要不你先试试其他方法转染看看...

7楼2015-11-23 17:06:13
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czfscf

金虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 632362481 at 2015-11-20 19:44:49
质粒都是测序过的,应该没啥问题吧,是不是转化效率低啊?我挑了十个了,是不是挑的少啊,我提基因组用OMEGAyeast kit提的,通用引物P的,你有没有做过?我这个是伯莱霉素筛选的,ppiczaB载体。...

我的事ppiczaA 一般都是一挑一个准的 你确定你的目的片段在质粒里面 ?如果你挑克隆时候都能在zeocin上长,说明质粒已经进去了啊,转化没有问题,那就是质粒不带目的片段了啊。这样的话你是不是用单酶切插入的你的目的片段,是的话,单酶切的自连很严重,我有时要12个里才能挑到一个positive

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Ecological Genomics;the scientific walking hormone
8楼2015-11-25 18:15:58
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632362481

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by czfscf at 2015-11-25 18:15:58
我的事ppiczaA 一般都是一挑一个准的 你确定你的目的片段在质粒里面 ?如果你挑克隆时候都能在zeocin上长,说明质粒已经进去了啊,转化没有问题,那就是质粒不带目的片段了啊。这样的话你是不是用单酶切插入的你的 ...

你说的对啊,然后昨天我又把电转完的产物重新涂了一下平板,又多加了zeocin,只涂了50ul左右,长成一大片,都不太好挑。哎   问题好多
。。。
9楼2015-11-26 09:26:35
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632362481

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 632362481 at 2015-11-26 09:26:35
你说的对啊,然后昨天我又把电转完的产物重新涂了一下平板,又多加了zeocin,只涂了50ul左右,长成一大片,都不太好挑。哎   问题好多...

我的是双酶切,测序验证过的。
。。。
10楼2015-11-26 09:32:50
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