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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 毕赤酵母表达
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632362481

铜虫 (小有名气)

[求助] 毕赤酵母表达 已有1人参与

想请教一下，最近在做毕赤酵母GS115表达，转化完，涂的YPDS平板，提取酵母基因组进行PCR验证，挑了10个菌落，发现都是空载体，没有转进去。怎么办？
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。。。
1楼 2015-11-20 16:03:37
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

czfscf

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
有可能是质粒出错 密码子木有做好  也有可能没有转进去 那就重新转。
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632362481
Ecological Genomics；the scientific walking hormone
3楼2015-11-20 18:37:09
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普通回帖

MarchZR

银虫 (小有名气)
毕赤酵母表达也属于真核细胞表达吧，没转进去，重新转啊，肯定是实验操作问题，，在试一遍
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2楼2015-11-20 17:02:28
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632362481

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by MarchZR at 2015-11-20 17:02:28
毕赤酵母表达也属于真核细胞表达吧，没转进去，重新转啊，肯定是实验操作问题，，在试一遍

都是电转，应该不会出啥错误吧？是不是我挑的比较少啊？还是转化效率比较低呢
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4楼2015-11-20 19:40:43
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632362481

铜虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by czfscf at 2015-11-20 18:37:09
有可能是质粒出错 密码子木有做好  也有可能没有转进去 那就重新转。

质粒都是测序过的，应该没啥问题吧，是不是转化效率低啊？我挑了十个了，是不是挑的少啊，我提基因组用OMEGAyeast kit提的，通用引物P的，你有没有做过？我这个是伯莱霉素筛选的，ppiczaB载体。
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。。。
5楼2015-11-20 19:44:49
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MarchZR

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 632362481 at 2015-11-20 19:40:43
都是电转，应该不会出啥错误吧？是不是我挑的比较少啊？还是转化效率比较低呢...

是细胞瞬时转染表达吧？可以用脂质体转染试试，通常转细胞的话，应该是比较容易转进去的吧，转化效率低也不会一个都没转进去吧，要不你先试试其他方法转染看看
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6楼2015-11-23 16:48:01
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632362481

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by MarchZR at 2015-11-23 16:48:01
是细胞瞬时转染表达吧？可以用脂质体转染试试，通常转细胞的话，应该是比较容易转进去的吧，转化效率低也不会一个都没转进去吧，要不你先试试其他方法转染看看...

好
7楼2015-11-23 17:06:13
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czfscf

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 632362481 at 2015-11-20 19:44:49
质粒都是测序过的，应该没啥问题吧，是不是转化效率低啊？我挑了十个了，是不是挑的少啊，我提基因组用OMEGAyeast kit提的，通用引物P的，你有没有做过？我这个是伯莱霉素筛选的，ppiczaB载体。...

我的事ppiczaA 一般都是一挑一个准的 你确定你的目的片段在质粒里面 ？如果你挑克隆时候都能在zeocin上长，说明质粒已经进去了啊，转化没有问题，那就是质粒不带目的片段了啊。这样的话你是不是用单酶切插入的你的目的片段，是的话，单酶切的自连很严重，我有时要12个里才能挑到一个positive
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632362481
Ecological Genomics；the scientific walking hormone
8楼2015-11-25 18:15:58
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632362481

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by czfscf at 2015-11-25 18:15:58
我的事ppiczaA 一般都是一挑一个准的 你确定你的目的片段在质粒里面 ？如果你挑克隆时候都能在zeocin上长，说明质粒已经进去了啊，转化没有问题，那就是质粒不带目的片段了啊。这样的话你是不是用单酶切插入的你的 ...

你说的对啊，然后昨天我又把电转完的产物重新涂了一下平板，又多加了zeocin，只涂了50ul左右，长成一大片，都不太好挑。哎   问题好多
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9楼2015-11-26 09:26:35
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632362481

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 632362481 at 2015-11-26 09:26:35
你说的对啊，然后昨天我又把电转完的产物重新涂了一下平板，又多加了zeocin，只涂了50ul左右，长成一大片，都不太好挑。哎   问题好多...

我的是双酶切，测序验证过的。
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10楼2015-11-26 09:32:50
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