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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细胞科学 » 质粒线性化和纯化步骤
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Esther_zhang

新虫 (初入文坛)

[求助] 质粒线性化和纯化步骤已有1人参与

虫友们，我做转染前想把质粒先用一个酶切位点线性化，不知道具体该如何操作，酶切位点是平末端的，要不要去磷酸化？
还有，如何纯化适合做后续的转染？
谢谢大家了，如果有具体的操作步骤，那更是极好的。
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1楼2015-11-17 11:12:15
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Esther_zhang

新虫 (初入文坛)
不要沉，自己顶一下。大家帮帮忙。
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2楼2015-11-17 13:02:58
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Esther_zhang

新虫 (初入文坛)
为什么没有人回复我
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3楼2015-11-18 13:53:07
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15853830932

木虫 (小有名气)
如果你想做去磷酸化也可以。这样保险点，其实自连不是很多的。酶切完你做个清洁，把盐离子等物质洗脱掉就可以做转化了。

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If you shed tear when you miss the sun, you also miss the stars.
4楼2015-11-18 16:36:19
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Esther_zhang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 15853830932 at 2015-11-18 16:36:19
如果你想做去磷酸化也可以。这样保险点，其实自连不是很多的。酶切完你做个清洁，把盐离子等物质洗脱掉就可以做转化了。

谢谢回复。请问质粒单酶切后要纯化才能做去磷酸化吗？去磷酸化后如何纯化？我看TAKARA公司的CIAP说明书，用酚氯仿的方法，不知道可行不可行？
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5楼2015-11-20 11:26:55
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15853830932

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Esther_zhang at 2015-11-20 11:26:55
谢谢回复。请问质粒单酶切后要纯化才能做去磷酸化吗？去磷酸化后如何纯化？我看TAKARA公司的CIAP说明书，用酚氯仿的方法，不知道可行不可行？...

清洁完才能去磷酸化，去磷酸化我们也是用CIAP酶，半个小时左右就可以了。你直接用酶就行了啊

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If you shed tear when you miss the sun, you also miss the stars.
6楼2015-11-20 15:11:11
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Esther_zhang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 15853830932 at 2015-11-20 15:11:11
清洁完才能去磷酸化，去磷酸化我们也是用CIAP酶，半个小时左右就可以了。你直接用酶就行了啊
...

嗯谢谢你了，我准备酶切完直接用乙醇沉淀法给回收一下。
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7楼2015-11-20 15:54:54
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396681592

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

做个去磷酸化处理还是比较保险的，我们实验室情况来看，NEB的酶去磷酸化效果比较好点。单酶切线性化自连的情况还是挺常见的。如果要是转染的话，后续纯化还是应当注意些，DNA要是不够纯怕是会影响细胞生长的吧。
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呵呵
8楼2015-11-27 15:36:25
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考研水平

新虫 (初入文坛)
我现在也在做体外转录实验，需要线性化质粒，能分享一下你的线性化质粒的具体步骤吗，包括后面乙醇沉淀法回收质粒的过程，谢谢！！！
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9楼2016-12-08 14:37:53
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zhlsgood

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 15853830932 at 2015-11-18 16:36:19
如果你想做去磷酸化也可以。这样保险点，其实自连不是很多的。酶切完你做个清洁，把盐离子等物质洗脱掉就可以做转化了。

请教一下：如何清洁，去除盐离子等物质？
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10楼2018-12-27 19:14:49
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