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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR失败求助
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acast

新虫 (正式写手)

[求助] PCR失败求助已有4人参与

大家好，我最近开始接触PCR，但是遇到一些问题，求大家指教。

我在公司定了一个质粒，上边有我的目的基因片段（3350 bp），我自己设计了引物，PCR之后，在电泳中发现了两条带，其中一个是正常大小，因此就把胶切下来，用试剂盒提取其中的DNA，然后跑胶，也得到了正确的条带。当我在用这纯化后的DNA，做模板，用相同的试剂和条件，再次PCR，为了得到更多的产物，发现PCR上边只有小于200 bp的条带。求这种第二次PCR有什么讲究，或者没成功有什么地方需要改正的吗？
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"Hope"and"Wait"
1楼2015-11-12 09:25:21
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sunchilde

铁虫 (初入文坛)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-11-14 22:57:01
“当我在用这纯化后的DNA，做模板，用相同的试剂和条件，再次PCR”
PCR有时候和模板浓度有关，模板太多的话，也P不出来。
你说的相同的试剂和条件是不是就是这个？

另外有人喜欢把胶图反过来放，你确定是你的3000+的条带被切下来了？？
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哈哈
2楼2015-11-12 11:11:38
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-字仲康

禁虫 (正式写手)
★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-11-14 22:57:14
本帖内容被屏蔽
3楼2015-11-12 11:17:49
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acast

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by -字仲康 at 2015-11-11 19:17:49
想要得到更多的产物，你可以就用之前的那个作为模版就好了啊。有小片段是出现引物二聚体了吧

那个片段不是引物二聚体 大概有个1100 bp的样子 该是引物连接到其他地方产生的了 问下 你觉得我的实验设计上又什么问题没有呢
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"Hope"and"Wait"
4楼2015-11-12 13:16:21
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xushiqi001

新虫 (小有名气)
建议你切胶回收测个序。

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5楼2015-11-12 13:19:16
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acast

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sunchilde at 2015-11-11 19:11:38
“当我在用这纯化后的DNA，做模板，用相同的试剂和条件，再次PCR”
PCR有时候和模板浓度有关，模板太多的话，也P不出来。
你说的相同的试剂和条件是不是就是这个？

另外有人喜欢把胶图反过来放，你确定是你的3 ...

关于切这个 我肯定没有切错

我在加模板的时候是先测过DNA的含量 然后按照了PCR的使用说明上的情况 同时 我也可以试几个浓度的梯度 你推荐个多大差别的浓度呢 比方说先的我用的1ul 试试 0.5ul 2ul 和 4ul 还是比较大的梯度比较好
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"Hope"and"Wait"
6楼2015-11-12 13:31:03
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acast

新虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by xushiqi001 at 2015-11-11 21:19:16
建议你切胶回收测个序。

发现这个还是要花一段时间才会有结果 我本来是想要这个片段 然后enzyme digestion，链接到一个vector aram上去的
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"Hope"and"Wait"
7楼2015-11-12 13:33:40
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-字仲康

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
8楼2015-11-12 13:36:26
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xushiqi001

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by acast at 2015-11-12 13:33:40
发现这个还是要花一段时间才会有结果 我本来是想要这个片段 然后enzyme digestion，链接到一个vector aram上去的...

有可能胶上看大小是对的，但实际上不是你要的产物，测序准确点，没多长时间，直接送回收产物也行，连到载体上也行。

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9楼2015-11-12 13:37:13
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acast

新虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by -字仲康 at 2015-11-11 21:36:26
PCR扩增，成功之后，然后进行进一步的扩增得到更多的产物，可以啊，这样没问题啊...

就是实验方法和步骤也什么需要注意的吗
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"Hope"and"Wait"
10楼2015-11-12 13:42:51
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