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请各位大神木虫帮我分析一下WB条带已有2人参与
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请各位大神木虫帮我分析WB条带 图1 和图2分别是目的蛋白，图3 是GADPH。我解释一下，一抗孵育过夜，然后急着发光看结果，就一抗洗了4次，5min／次。二抗孵育1h。二抗洗3次， 5min／次。发现目的蛋白背景太黑了。是不是也是一抗特异性不强的缘故啊？ 多谢各位虫子，虚心请教。  屏幕快照 2015-11-03 下午10.29.45.png  屏幕快照 2015-11-03 下午10.29.52.png  屏幕快照 2015-11-03 下午10.31.13.png |
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keke226
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
蛋白小王子6: 金币+15, ★★★很有帮助 2015-11-04 13:38:56
感谢参与，应助指数 +1
蛋白小王子6: 金币+15, ★★★很有帮助 2015-11-04 13:38:56
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封闭液用的是什么？脱脂奶粉效果比BSA稍好。 一抗的稀释比例和孵育时间都可以调整一下试试。另外，二抗的孵育时间也可以缩短为30到40分钟试试。 曝光时间也可以缩短。 好的结果都是要不断优化实验条件的。 发自小木虫Android客户端 |
2楼2015-11-03 23:05:08
3楼2015-11-04 13:01:15
keke226
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蛋白小王子64楼2015-11-04 13:07:32
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liweiwaxmc
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6楼2015-11-04 21:57:44
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你好 多谢你的建议，因为内参和目的蛋白是在同一张膜上孵育的，内参没有问题，说明封闭应该不会太差。第二点我挺赞成的。就是一抗可能浓度太高。染了非特异性条带。今天下午和同学讨论了下，他说可能是我的洗膜时间太短了。我记着开组会。一抗 二抗平均洗了3次 每次5min。然后我同学说他洗4-5次 每次10min。 我觉得这个也有关系，谢谢你。 发自小木虫IOS客户端 |
7楼2015-11-04 23:47:46
liweiwaxmc
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8楼2015-11-05 00:15:20
babysheep963
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我这儿也是失败案例，同样一抗稀释1000倍，4℃结合过夜，但回收重复使用三次。封闭一抗二抗都是用TBST5min/次，重复6次放摇床洗涤。曝光时间10-30都用过，不知道这里是否有问题。敢问楼主曝光多久？我这做出来背景深到整个片子一泡污，焦急分析步骤中…… 发自小木虫Android客户端 |
9楼2015-11-12 13:39:48
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收到 先回答你曝光时间的问题 GA的话表达高 曝光10s内足够了，磷酸化的蛋白我最久的曝光了7分钟。 背景值的问题我感觉和摇床洗膜也有关系，要使劲摇，让膜晃起来。 发自小木虫IOS客户端 |
10楼2015-11-12 13:56:43